Incontro tra l’estremità N-terminale e l’acetilazione

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on March 17, 2014 by Domenico Delfino

La decisione del destino cellulare è strettamente legata allo stato energetico della cellula.  Yi et al. (2011) introducono un meccanismo per cui Bcl-xL abbassa la soglia dell’apoptosi attraverso la soppressione della produzione di acetil-CoA, che, a sua volta, sopprime l’N-alpha acetilazione importante per l’attivazione della proteasi proapoptotica caspasi-2.

 

Una decisione cellulare di morire per apoptosi, divenire quiescente, o proliferare è influenzata dalle condizioni metaboliche della cellula e del tessuto che la circonda.  Nei 10 anni passati, molteplici studi hanno stabilito un legame diretto tra queste vie cellulari critiche.  Per esempio, quando i livelli di glucosio fluttuano, le vie sensorie del glucosio trasducono segnali attraverso la chinasi Akt per alterare le modificazioni post-traslazionali e/o i livelli di espressione delle proteine della famiglia Bcl-2.  Ancora più complesso, dato il grande ventaglio di metaboliti nella cellula e l’intricato circuito metabolico di cui si nutrono, è stata la delucidazione delle interazioni tra piccoli metaboliti e le vie di segnale del destino cellulare.  Yi et al adesso dimostrano che la potenza antiapoptotica della proteina Bcl-xL origina in parte dalla sua capacità di abbassare i livelli di acetil-CoA, un substrato di proteine acetiltransferasiche (figura 1).  Ciò determina una diminuita N-alpha acetilazione di molteplici regolatori apoptotici, tra cui le caspasi ed il membro proapoptotico della famiglia Bcl-2 Bax, aumentando in questo modo la resistenza a stimoli apoptotici.

Figura 1.  Regolazione dell'apoptosi da parte di Bcl-xL Oltre a bloccare direttamente l'oligomerizzazione di Bax/Bak ed il rilascio di citocromo c dai mitocondri, Bcl-xL abbassa anche i livelli di acetil-CoA (possibilmente a causa di un effetto indiretto a monte dell'acetil-CoA), il chè risulta in una diminuzione della N-Alpha-acetilazione di mediatori apoptotici come caspasi-2, -3, -9 e Bax.  Nel caso della caspasi-2, l'N-Alpha-acetilazione è critica per la sua attivazione.

Figura 1. Regolazione dell’apoptosi da parte di Bcl-xL
Oltre a bloccare direttamente l’oligomerizzazione di Bax/Bak ed il rilascio di citocromo c dai mitocondri, Bcl-xL abbassa anche i livelli di acetil-CoA (possibilmente a causa di un effetto indiretto a monte dell’acetil-CoA), il chè risulta in una diminuzione della N-Alpha-acetilazione di mediatori apoptotici come caspasi-2, -3, -9 e Bax. Nel caso della caspasi-2, l’N-Alpha-acetilazione è critica per la sua attivazione.

                Enzimi distinti controllano l’acetilazione N-terminale delle proteine e l’acetilazione dei residui di lisina. L’acetilazione della lisina è apprezzata sempre di più come evento dinamico di segnale, mentre il ruolo della N-alpha acetilazione è più enigmatico.  L’N-alpha acetilazione è catalizzata dalla acetiltransferasi N-terminale (le NAT – che vanno dalla NatA alla NatF negli eucarioti) e si pensa che aiuti l’appropriata funzione, localizzazione, e stabilizzazione di certe proteine.  Tuttavia, la N-alpha acetilazione è considerata irreversibile, e studi precoci hanno dimostrato che molte proteine eucariotiche hanno questa modificazione, bollandola come modificazione globale necessaria per la funzione di molte proteine.  Le scoperte di Yi e coll suggeriscono che l’N-alpha acetilazione può avere più sfumature e varietà di ruoli biologici.

                Per monitorare l’N-alpha acetilazione delle proteine, gli autori usano una strategia inteliggente che coinvolge la biotinilazione mediata da subtiligasi e il legame dell’avidina solo delle proteine con un’estremità N-terminale libera.  Questi esperimenti rivelano che l’N-alpha acetilazione di regolatori dell’apoptosi è sensibile a cambiamenti acuti dei livelli di acetil-CoA, e ciò suggerisce che la soglia cellulare di morte è intimamente legata, attraverso questa modificazione, allo stato dei nutrienti.

                L’idea che una modificazione posttraslazionale come l’N-alpha acetilazione è regolata da livelli del substrato donatore, acetil-CoA, piuttosto che dagli enzimi che catalizzano la modificazione va contro il buon senso concernente altre modificazioni come fosforilazione, dove il donatore di fosfato ATP tipicamente non è limitante.  E’ interessante che una ancora piccola ma crescente letteratura suggerisca che l’acetilazione delle proteine è influenzata proprio dai livelli fluttuanti di acetil-CoA.  Per esempio, la stimolazione della produzione di acetil-CoA mediata dal glucosio attraverso la citrato liasi citrato/ATP determina un’aumentata acetilazione dell’istone e conseguente trascrizione di regolatori metabolici.  Queste osservazioni e quelle di Yi et al. implicano che i cambiamenti di un singolo metabolita, acetil-CoA, possano avere un grande effetto ondulatorio, alterando le vie di trascrizione, i circuiti metabolici, e la sensibilità apoptotica.

                La regolazione dell’acetilazione N-terminale probabilmente avviene anche a livello di acetiltransferasi.  Infatti, i complessi NAT mostrano preferenze diverse per sequenze di specifici amminoacidi N-terminali.  Inoltre, Yi et al. mostrano che l’ablazione mediata da RNAi di ARD1, un componente del complesso NatA, sensibilizza le cellule all’apoptosi e risulta nel fallimento dell’acetilazione N-terminale di una sottopopolazione di regolatori apoptotici.  Quindi, diverse NAT possono avere come bersaglio gruppi specifici di proteine.  Quindi, sfruttare l’approccio con la subtiligasi sviluppato da Yi e coll. per identificare i substrati di singole NAT dovrebbe essere illuminante.

                L’effetto antiapoptotico di Bcl-xL è generalmente attribuito alla soppressione del rilascio di citocromo c attraverso l’inibizione di Bax/Bak.  Tuttavia, più di una decade fa, il laboratorio di Harwick ha dimostrato che i mutanti di Bcl-xL incapaci di legare Bax/Bak mantengono ancora fino all’80% della loro attività antiapoptotica.  Yi et al mostrano che quegli stessi mutanti sopprimono i livelli di acetil-CoA, suggerendo che alterare l’acetilazione N-terminale della proteina attraverso la modulazione di questo metabolita possa contribuire significativamente all’attività anti-apoptotica di Bcl-xL.

                Ovviamente, questi dati fanno sorgere la domanda di come Bcl-xL influenza i livelli di acetil-CoA.  In condizioni di eccesso di glucosio, il citrato, un prodotto del ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA), esce dai mitocondri ed è convertito ad acetil-CoA dall’ATP citrato liasi.  E’ interessante che Yi e coll mostrino che la produzione stimolata di acetil-CoA, dovuta ad aggiunta di citrato al medium di coltura, sensibilizza le cellule alla morte indotta da doxorubicina, mentre l’ablazione da RNAi di ATP citrato liasi abroga questo effetto.  Per confermare ciò ulteriormente, Yi et al hanno scoperto che  i livelli di citrato sono ridotti in cellule che esprimono Bcl-xL.  Quindi, Bcl-xL forse svolge il proprio effetto sui livelli di acetil-CoA inibendo la produzione e/o l’esportazione di citrato.  Gli autori suggeriscono che Bcl-xL blocchi l’esportazione di citrato dal mitocondrio interagendo con il canale anionico dipendente dal voltaggio (VDAC), un componente del complesso dei pori mitocondriali che può regolare l’efflusso del metabolita.  L’espressione di Bcl-xL può inibire anche la proliferazione, che indirettamente potrebbe influenzare i livelli di acetil-CoA riducendo l’attività del ciclo TCA.  A questo proposito, è interessante notare che le attività che ritardano il ciclo cellulare e quelle antiapoptotiche di Bcl-xL co-segregano nei mutanti di Bcl-xL.  Inoltre, l’espressione di Bcl-xL altera le dinamiche della fusione/fissione mitocondriale che possono impattare nel metabolismo mitocondriale.

In una varietà di tipi tumorali, l’espressione di Bcl-xL è critica per la sopravvivenza cellulare e, quindi, è considerato un bersaglio terapeutico promettente.  Il lavoro di Yi et al. solleva argomenti importanti  a proposito del bersaglio di Bcl-xL e i suoi soci di segnale.  Per esempio, in cellule tumorali in cui, Bcl-xL è altamente espresso, come l’abbassamento dei livelli di acetil-CoA influenza le necessità biosintetiche della cellula, in particolare per la sintesi degli acidi grassi? Che effetto ha Bcl-xL sull’acetilazione della lisina, che ha anche bisogno di acetil-CoA e probabilmente avrebbe un impatto sulle vie metaboliche del cancro?  Nonostante queste ed altre domande rimangano, Yi et al forniscono delle forti evidenze di un meccanismo semplice ed elegante attraverso cui i livelli di un singolo metabolita, l’acetil-CoA, può regolare direttamente la sensibilità cellulare all’apoptosi.

(Tratto da Joshua L. Andersen e Sally Kornbluth, “Meeting the (N-terminal) End with acetylation”, Cell 146, August 19, 2011)

Mi scusi dottore

Posted in libri with tags , , , on March 10, 2014 by Domenico Delfino

Posso tirare bei soldoni

” La donna è stata tamponata da un auto mentre viaggiava col motorino ed il figliolo dodicenne sul portapacchi.

Il ragazzo ha riportato una ferita al ginocchio che ha richiesto dodici punti di sutura al pronto soccorso ed escoriazioni multiple.  Lei contusioni ed escoriazioni in varie parti del corpo.

Viene in ambulatorio allo scadere dei venti giorni di prognosi del figlio (per lei ne erano previsti dieci) e porta con sé i referti dell’ospedale.

“Dottore, sono stata dall’avvocato e mi ha detto che mi deve fare i certificati, tre mesi per lui e due per me”.

“Mi faccia vedere i referti, devo vedere la ferita, ci vorranno accertamenti.  La botta è stata grossa per entrambi, ma come si fa a stabilire in anticipo con esattezza quanti giorni ci vorranno? Daremo i giorni necessari.

“Senta dottore, l’avvocato ha detto così, ha detto anche che i certificati li può fare qualunque medico, perciò se non li fa lei mi rivolgo ad un altro”.

La donna che parlava sembrava un’altra, non era più la ragazza educata e rispettosa che da tanti anni veniva in ambulatorio per i suoi consulti.  Ora i suoi occhi avevano uno sguardo cattivo, la voce e i lineamenti mostravano una decisione inconsueta.

“Quella dell’avvocato è una questione assicurativa, la mia una questione medica.  I certificati devono seguire l’evoluzione delle ferite, vanno fatti sino alla guarigione, ma non le posso dire in anticipo quanti giorni ci vorranno.  Può darsi che siano necessari più di tre mesi, ma adesso è prematura ogni ipotesi”.

“Niente da fare.  L’avvocato ha detto che con un incidente del genere si possono tirare bei soldoni.  Ha parlato di milioni, senza tener conto dei postumi”.

“Mi pare che lei sia più preoccupata dei soldi che della salute di Simone (si chiamava così il figlio).  E poi attenzione a parlare di postumi, vogliono dire anche danni permanenti per il ragazzo.  Le piacerebbe che rimanesse zoppo per tutta la vita?”:

La signora non intende ragioni e taglia corto:

“Intanto mi faccia i certificati, poi si vedrà”.

Andò a finire che dopo i primi due certificati si rivolse ad un altro sanitario ed io la persi di vista.

Questa la mentalità nell’anno di grazia 1998.

Quando capita un incidente, prima di andare dal medico l’infortunato fa una capatina dall’avvocato per sapere quanto può ricavare o quanto può rimetterci.

Il legale è pagato per dare consigli:” Mi porti i certificati per novanta giorni e poi mi incaricherò io di farle avere i quattrini”.

Il medico si trova, così, stretto tra la coscienza professionale, l’interesse dell’assistito, e la possibilità di perdere il paziente: è un trilemma di non facile soluzione.”

(Tratto da Francesco Giuseppe Romeo “Mi scusi dottore – splendori e miserie di una nobile arte”, Mosby Italia, 1998)

Involuzione e rigenerazione del timo: due facce della stessa medaglia?

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on March 6, 2014 by Domenico Delfino

Riassunto.  Nei vertebrati, il timo è il sito principale di sviluppo delle cellule T.  Il timo raggiunge la sua produzione massima durante l’adolescenza, dopodichè si rimpicciolisce e genera sempre meno cellule T.  L’involuzione fisiologica del timo dovuta all’età e l’incapacità di recuperare dopo un danno sono associati all’alterata immunità cellulare; adesso, c’è un considerevole interesse nello sviluppo di strategie per combattere queste deficienze.  In questo articolo d’opinione, noi riassumiamo brevemente le caratteristiche fondamentali filogenetiche ed ontogenetiche dello sviluppo e della funzione del timo, e discutiamo i modelli sperimentali di alterata timopoiesi ed i meccanismi molecolari del recupero timopoietico.  A ciascuno stadio della discussione metteremo in luce le principali lacune nelle nostre conoscenze attuali.

Gli organi linfoidi primari, come il timo, forniscono i microambienti specializzati che sono necessari per lo sviluppo delle cellule linfoidi.  Inoltre, supportano i passi del controllo qualitativo che assicurano la generazione di un repertorio di recettori per l’antigene tollerante al self.  Nei vertebrati, lo sviluppo delle cellule T dipende dalla presenza di un timo funzionante.  E’ rimarchevole che l’entità dello sviluppo delle cellule T è alquanto variabile durante la vita di un animale; la produzione delle cellule T inizia durante l’embriogenesi, e raggiunge il suo picco durante l’infanzia, ma successivamente declina lentamente fino a quasi fermarsi nella vecchiaia.  Nonostante questo processo dinamico abbia affascinato gli immunologi per lungo tempo, la comprensione dei meccanismi che sono responsabili di questo processo è ancora piuttosto limitata.  Per esempio, nonostante molti immunologi siano d’accordo che l’involuzione del timo è un processo negativo che sottolinea il deterioramento dipendente dall’età delle funzioni immuni, l’involuzione potrebbe invece essere adattiva e quindi avere qualche funzione sconosciuta ma importante.  In anni recenti, l’interesse nella possibilità di restaurare l’attività timopoietica è aumentata con l’acquisizione che molte condizioni mediche influenzano le attività fisiologiche del timo.  In questo articolo, riassumiamo le nostre conoscenze sull’ontogenesi del timo, mettiamo in luce temi non risolti e suggeriamo future direzioni di ricerca.

Formazione dell’epitelio timico

Il microambiente epiteliale del timo si sviluppa dalle cellule endodermiche della terza tasca faringea che sono localizzate in stretta relazione con le paratiroidi primordiali (Fig. 1).  L’espressione del gene che codifica per il fattore di trascrizione forkhead box protein 1 (FOXN1) è considerata generalmente il marcatore della costruzione verso il destino timico dell’epitelio faringeo.  Tuttavia, FOXN1 non può avere da solo la responsabilità del fenotipo timopoietico delle cellule epiteliali, come è chiaramente dimostrato dalla mancanza di questa capacità nei cheratinociti cutanei (che sono il secondo sito di maggiore espressione di Foxn1 dopo il timo).  Usando un’analisi differenziale di espressione genica degli epiteli endodermici ed ectodermici che esprimono Foxn1, sarebbe possibile identificare i cofattori rilevanti di FOXN1 che facilitano la timopoiesi.  I meccanismi attraverso i quali l’espressione di Foxn1 è indotta nell’endoderma faringeo non sono conosciuti, ma probabilmente coinvolgono un complesso gioco di relazioni di proteine morfogenetiche dell’osso (le BMP) e sonic hedgehog (SHH), e forse anche le vie di segnale WNT, con il contributo del fattore di trascrizione T-box TBX1, della proteina homeobox HOXA3, delle paired box proteins PAX1, PAX3 e PAX9, e di membri delle famiglie di fattori di trascrizione sine oculis homeobox (SIX) e di eyes absent homologue 1 (EYA1).  L’architettura delle reti genetiche che stanno alla base dello sviluppo degli organi faringei, come il timo, le paratiroidi, i corpi ultimobranchiali e la tiroide non è ben conosciuta; tuttavia, queste informazioni sarebbero importanti se si considerasse la riprogrammazione in vitro ed in vivo di cellule epiteliali non timiche verso il fenotipo timico che sarà discussa più avanti.

Boehm fig 1

Figura 1.  Sviluppo delle TEC.  I progenitori bipotenti delle cellule epiteliali timiche (TEC) si sviluppano dall’endoderma della terza tasca faringea; queste cellule esprimono il fattore di trascrizione forkhead box protein N1 (FOXN1).  Sono stati compiuti vari tentativi  di derivare questo tipo di cellule usando la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali e staminali pluripotenti indotte (iPS).  Si pensa che i progenitori bipotenti diano origine a TEC corticali (cTEC) e midollari (mTEC) mature passando per progenitori specifici di compartimento.  Ambienti simil-cTEC sono stati generati dalla riprogrammazione genetica in vivo ed in vitro usando tra i fattori specifici, per esempio, il Notch ligand 1 delta-like ligand 4 (DLL4) e CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12); non è stata ancora riportata la generazione di ambienti simil mTEC da sorgenti non affini, per esempio, attraverso l’espressione di lymphotoxin-β receptor (LTβR), RANK ligand (RANKL) e CD40 ligand (CD40L).

                Lo studio dei topi che sono deficienti di fibroblast growth factor receptor 2 IIIb (FGFR2IIIb) ha indicato che il segnale mediato da FGF da cellule mesenchimali positive per platelet-derived growth factor receptor-α (PDGFRα) aumenta il numero delle cellule epiteliali timiche (TEC) nel rudimento timico, ma non ne influenza né la formazione iniziale né la loro differenziazione.  Non si sa se l’effetto proliferativo dell’FGF abbia come bersaglio i progenitori epiteliali o la loro progenie più differenziata, o entrambi.  Allo stesso modo il ruolo dei segnali di BMP, ephrin e WNT negli eventi post-induttivi deve essere ancora studiato.  Un ostacolo principale al progresso in questa area è la mancanza di sistemi transgenici che abbiano come bersaglio in prospettiva il rudimento timico prima dell’inizio di espressione di Foxn1.

                La perdita dell’espressione di Foxn1 causa la perdita da parte dell’epitelio timico della propria capacità funzionale e l’assunzione di un fenotipo che è spesso associato alla formazione di cisti epiteliali, nel quale l’epitelio assume una morfologia stratificata bidimensionale, che ricorda altri organi derivati dall’intestino esterno come i polmoni.  

Differenziazione di progenitori TEC

In assenza della funzione di FOXN1, il timo rudimentale si sviluppa ma non si differenzia, il chè indica che questi due processi sono geneticamente separati.  Nonostante generalmente si consideri che l’epitelio deficiente di FOXN1 rappresenti uno stato immaturo simil-progenitore, non è chiaro se questa sia una proprietà di tutte o solo di una frazione delle cellule epiteliali indifferenziate nel timo rudimentale mutante.  Rispondere a questa domanda è importante, in quanto fornirebbe un mezzo per sviluppare un profilo fenotipico per l’isolamento in prospettiva di progenitori TEC, che ancora non è stato ottenuto.  Studi funzionali hanno fornito evidenze della presenza di progenitori bipotenti delle TEC corticali (cTEC) e delle TEC midollari (mTEC), e ci sono ulteriori evidenze sulla presenza di precursori intermedi specifici per compartimento (BOX 1; Fig. 1).  Evidenze recenti indicano che lo sviluppo delle TEC coinvolge uno stadio in cui cellule progenitrici bipotenti possono co-esprimere caratteristiche fondamentali delle linee cTEC ed mTEC attraverso l’acquisizione sequenziale di queste caratteristiche, che evidenziano il bisogno di definire meglio le caratteristiche fenotipiche delle due linee TEC principali.

Un’altra area di incertezza riguarda i segnali che causano la differenziazione dei precursori bipotenti verso sotto-linee diverse di TEC.  E’ possibile che la differenziazione nella linea cTEC rappresenti una via da mancanza di stimoli della differenziazione TEC, mentre sembra che lo sviluppo di mTEC sia dipendente da stimoli aggiuntivi, per esempio, attraverso l’interazione con diversi tipi cellulari ematopoietici.  C’è bisogno di tracciare con alta risoluzione la linea per determinare il destino dei diversi tipi di TEC.  L’espressione di una ricombinasi Cre condizionalmente attiva in una piccola percentuale di TEC di una data sottopopolazione (per esempio, cTEC ed mTEC) potrebbe essere usata per esaminare le relazioni delle TEC e la loro possibile conversione e la loro cinetica intratimica in situ; sfortunatamente, per risolvere questo problema, ci sono al momento troppe poche linee di topi Cre che abbiano come specifico bersaglio i diversi tipi di TEC.  E’ da notare che la riduzione congenita o la perdita perinatale acquisita di tessuto timico non viene compensata più tardi in vita, il chè suggerisce che la capacità rigenerativa dell’epitelio timico è limitata.

Ambienti timopoietici

La generazione de novo di TEC.  Nonostante le nostre limitate conoscenze sul circuito genetico che da origine alle TEC, sono stati compiuti vari tentativi di generare progenitori TEC usando la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS).  Brevemente, cellule staminali pluripotenti sono state esposte in maniera sequenziale a segnali che influenzano le vie di segnale di activin, WNT, FGF e BMP nello sforzo di riassumere la presunta sequenza embrionale di differenziazione endodermica; è stato anche descritto un approccio alternativo in vivo per generare TEC funzionali da cellule staminali embrionali in animali chimerici.  Tuttavia, nonostante i fenotipi riportati fossero compatibili con la generazione di progenitori TEC, rimangono molte domande importanti a riguardo della stabilità fenotipica e della capacità funzionale delle TEC che sono state generate in vitro.  La stabilità fenotipica è una ovvia preoccupazione in quanto i progenitori TEC possono essere convertiti in cheratinociti cutanei in seguito a segnali ambientali appropriati.  Questa è una scoperta rimarchevole dal momento che l’epitelio timico ed i cheratinociti traggono origine da due diversi strati germinali.  Il normale microambiente timico è eccezionalmente efficiente nel sostenere lo sviluppo di cellule T; in termini di numero cellulare, le cellule T numericamente superano le cellule epiteliali di un fattore di circa 1000.  Non è chiaro se con le TEC che sono state generate in vitro si ottenga questo livello di attività timopoietica.

                Usando protocolli di differenziazione in vitro molto simili, Parent et al. e Sun et al. hanno recentemente generato cellule epiteliali da cellule staminali embrionali umane, che ricordano per molti aspetti il fenotipo dei progenitori TEC.  Dopo il trapianto in topi nudi atimici, sono emerse cellule T periferiche che, nonostante un’apparente oligoclonalità, sono state giudicate funzionali come valutato tramite stimolazione allogenica in vitro e rigetto del trapianto di cute.  Questo è un risultato sorprendente, dal momento che l’analisi quantitativa del tessuto timopoietico aveva indicato la presenza soltanto di un piccolo numero di cellule epiteliali e che queste avevano una capacità timopoietica di diversi ordini inferiore rispetto a quella delle controparti timiche normali.  Quindi, c’è un bisogno urgente di migliorare il risultato numerico e la capacità funzionale delle TEC generate in vitro.

                I protocolli usati attualmente per la differenziazione in vitro potrebbero essere migliorati dall’incorporazione di colture organotipiche, come quelle recentemente riportate per le mTEC; finora, non è stato adottato un approccio simile.  Nonostante ciò, studi di questo tipo dovrebbero essere attuati vigorosamente, dal momento che modelli in vitro hanno le potenzialità di fornire mezzi facili per interrogare il ruolo di un gruppo di fattori che sono stati implicati nella differenziazione e nella funzione di cTEC ed mTEC.     

Ambienti timopoietici artificiali.   Come alternativa alla generazione de novo di progenitori TEC, sono stati compiuti tentativi di ricostituire alcune caratteristiche degli ambienti timici con mezzi artificiali, inizialmente in studi in vitro e poi usando la ricostituzione in vivo.  Collettivamente, questi studi hanno confermato il ruolo decisivo del ligando di Notch 1 delta-like ligand 4 (DLL4) come un determinante chiave dell’induzione della linea cellulare T.  Nel caso della ricostituzione in vivo, la presenza aggiuntiva di CXC-chemochine ligand 12 (CXCL12) crea un ambiente in rudimenti timici deficienti di FOXN1 che attrae cellule progenitrici linfoidi e che conduce alla generazione di cellule T CD4+CD8+.  Nonostante questi successi, rimane un vuoto considerevole nelle nostre conoscenze rispetto alla ricostituzione di ulteriori aspetti delle interazioni linfo-stromali che sono cruciali per la successiva differenziazione delle cellule T.  Per esempio, sarà necessario ottenere un’appropriata vascolarizzazione dei tessuti ingegnerizzati, dal momento che lo spazio perivascolare (PVS) è di particolare importanza come zona di transito per l’immigrazione dei precursori emopoietici e per l’emigrazione delle cellule T mature (Fig. 2A).  Allo stesso modo, la segregazione anatomica in regioni corticale e midollare del microambiente stromale, e le loro nicchie associate ad uno specifico stadio (Fig. 2A), non sono state ancora riprodotte negli esperimenti di ricostituzione timica riportati.  Tuttavia, anche se si pensa che la corteccia ed il midollo forniscono importanti suggerimenti locali per guidare la migrazione e la differenziazione delle cellule T in sviluppo, queste interazioni precisamente controllate non sono essenziali per la formazione per un repertorio delle cellule T funzionalmente competente, anche se possono essere necessarie per l’induzione efficace della tolleranza centrale.  E’ interessante notare che l’assenza di interazione linfo-stromali durante gli stadi precoci dello sviluppo timico non prevenga  lo stabilirsi di ambienti timopoietici funzionali in stadi più tardivi della vita; la funzione timopoietica rimane dormiente per un considerevole lasso di tempo e può persino essere ristabilito quando l’attività FOXN1 è restaurata in TEC di topi deficienti di FOXN1 dopo la nascita.

Boehm fig 2

Figura 2.  Interazioni linfo-stromali alla base dello sviluppo delle cellule T.  a) E’ mostrata una rappresentazione dello sviluppo delle cellule T come successione di distinte interazioni linfo-stromali.  b) Sono mostrati il declino coordinato di progenitori in arrivo e le cellule epiteliali timiche FOXN1+ (forkhead box protein N1).  c)  è mostrato il ridotto sviluppo di cellule T come conseguenza del deterioramento funzionale delle nicchie specifiche di stadio per la nicchia della cellula CD4-CD8- doppio negativa 1 (DN1).  d)  Sono mostrati gli aggiustamenti dello sviluppo delle cellule T che risultano da modificazioni dello spazio perivascolare.   

Lezioni dagli esperimenti della natura.  Con lo scopo di stabilire un gruppo fondamentale di fattori timopoietici, l’analisi molecolare di fenomeni naturali meno noti può fornire intuizioni sulla generazione timica.  Per esempio, gli epiteliomi delle ghiandole salivari che emergono dopo un’infezione da virus polioma dei topi spesso contengono cellule T dal fenotipo CD4+CD8+ immaturo; e, in alcune specie di uccelli, l’influenza stagionaleconverte il timo in un sito di vigorosa eritropoiesi a spese dell’analoga attività linfopoietica.  Questi esempi ed i risultati degli esperimenti di ricostituzione in vivo con la somministrazione di diverse combinazioni di chemochine e citochine mostrano una rimarchevole plasticità funzionale di questo ambiente emopoietico.  Infine, la comprensione della timopoiesi potrebbe anche beneficiare dall’analisi comparativa di organismi evolutivamente distanti.  La presenza di tessuto timopoietico è una caratteristica dei sistemi immuni dei vertebrati, come è stato recentemente dimostrato dalla scoperta dell’equivalente timico nella larva della lampreda.  Nonostante che la diversa morfologia dei tessuti timopoietici in vertebrati senza mascella indichi che la progenie di singoli progenitori TEC potrebbe disperdersi  in singoli filamenti branchiali piuttosto che riunirsi in un organo solido come nei vertebrati con mascella, i costituenti molecolari di base sembrano essere simili nei due gruppi fraterni di vertebrati.  Dal momento che pesci senza mascella e vertebrati con mascella usano fondamentalmente tipi diversi di recettori per l’antigene e meccanismi di diversificazione somatica, le funzionalità comuni che caratterizzano un ambiente timopoietico vertebrato potrebbero essere smascherate più facilmente dal paragone tra questi due gruppi di vertebrati che con il paragone tra specie all’interno dei due gruppi.  

Vita e tempi del timo

Quadri di crescita durante gli stadi embrionali e adolescenziali di sviluppo.  I punti di sviluppo nel tempo quando il rudimento epiteliale del timo comincia a differenziare e a diventare recettivo ai progenitori immigranti linfoidi varia da specie a specie; per esempio, il timo è colonizzato il terzo giorno dopo la fertilizzazione del zebrafish, al giorno embrionale 12 nel topo, e al giorno embrionale 60 nell’uomo.  Le fasi precoci dello sviluppo timico sono caratterizzate da crescita rapida, come risultato di una vigorosa proliferazione e differenziazione delle TEC e delle cellule T; nei topi, il timo raggiunge le sue massime dimensioni a circa 6 settimane di età, dopo di chè comincia a restringersi (Fig. 3).  E’ interessante notare che gli androgeni inducono un declino più rapido, il chè risulta in dimorfismo sessuale delle dimensioni timiche tra femmine e maschi per molta parte della vita adulta.  Infatti, l’ablazione di ormoni sessuali da castrazione è associata con un aumento transitorio nel numero delle cellule T nel timo; è degno di nota che questo ha solo un piccolo effetto a lungo termine sul compartimento stromale, il chè indica che il sesso degli animali non influenza i cambiamenti fisiologici nel timo che sono associati con l’età.

Boehm fig 3

Figura 3.  Concentrazione ed espansione delle popolazioni TEC in situazioni diverse.  a) Il numero di cellule epiteliali timiche (TEC) inizialmente aumenta e poi diminuisce gradualmente nel tempo in una situazione normale.  La capacità timopoietica è misurata dal rapporto delle cellule T per TEC e questo può cambiare col tempo.  b) è mostrato l’incremento per la durata della vita nel numero delle TEC che, per esempio, ha indotto una eccessiva espressione di forkhead box protein N1 (Foxn1) ed il blocco del transforming growth factor-β receptor 2 (TGFβR2) (curva rossa).  Questi effetti possono essere spiegati da un aumento dell’insieme dei progenitori TEC (vedi Box 1); per paragone viene mostrato il grafico delle cellule normali (curva grigia).  Quando il compartimento timico è ridotto di dimensioni (come risultato di una malformazione congenita o di timectomia parziale perinatale), si osserva raramente una crescita compensatoria (linea arancione).  c) Il numero delle TEC declina dopo un insulto al timo, come un’irradiazione, o un’ablazione specifica di tipi cellulari.  Nonostante il numero delle TEC recuperi, non ci sono informazioni sulle conseguenze a lungo termine.  Se il numero delle TEC segue eventualmente la traiettoria delle cellule normali, la rigenerazione deve indurre un aumento dei progenitori TEC (linea rossa tratteggiata); se il numero delle TEC cade più rapidamente del normale (linea arancione tratteggiata), il recupero probabilmente aumenta transitoriamente il ritmo di differenziazione dei progenitori, che causerebbe una prematura deplezione dell’insieme dei progenitori.  Per paragone è mostrato il grafico delle cellule normali (grigio).  d) Altre condizioni, come l’ablazione degli ormoni sessuali o il trattamento con fibroblast growth factor 7 (FGF7), aumenta, almeno transitoriamente, il numero delle TEC; un follow-up a lungo termine indicherà se questi interventi aumentano i progenitori TEC (linea rossa tratteggiata) o semplicemente aumentano il ritmo di differenziazione dei progenitori (linea arancione tratteggiata).  Per paragone è mostrato il grafico delle cellule normali (grigio).  

                Il rapido declino delle dimensioni del timo in età adulta è considerato un processo negativo, dal momento che è associato con una ridotta produzione di cellule T naive, che determina una ridotta immunocompetenza.  Tuttavia, come può sembrare intuitivo, l’involuzione timica forse riflette il “meno peggio” ed infatti forse ha un valore adattativo; questa interpretazione è supportata dall’osservazione che l’involuzione timica sembra sia un processo evolutivamente conservato.  E’ stato recentemente scoperto che un flusso diminuito di progenitori linfoidi dal midollo osseo è associato con un rischio di sviluppare leucemia a cellule T.  Ciò è stato attribuito ai tempi sproporzionatamente lunghi durante i quali le cellule T risiedono in nicchie intratimiche inappropriate allo sviluppo, che sono possibilmente situate nel compartimento corticale del timo.  Appena i progenitori ematopoietici nel midollo osseo generano sempre meno precursori linfoidi con l’aumento dell’età, una proporzionale riduzione della capacità ematopoietica potrebbe essere necessaria per evitare l’insorgenza di un ambiente pro-leucemico nel timo.  La capacità timopoietica potrebbe essere regolata a diversi livelli; per esempio, la perdita di TEC che esprimono FOXN1 ridurrebbe la capacità funzionale del timo (Fig. 2b).  Ci si aspetterebbe che lo stesso possa accadere se la riduzione della capacità funzionale del timo influenza solo le nicchie epiteliali limitanti (per esempio, la nicchia per le cellule T CD4-CD8- doppio negative 1 (DN1)(Fig. 2d).

                Molte osservazioni suggeriscono che il numero di TEC che esprimono FOXN1 declinano lentamente nei topi adulti, il chè indica che questo fenomeno potrebbe sottintendere una diminuzione graduale dell’attività timopoietica.  Ciò è molto ovvio in situazioni di rigenerazione timica, la cui entità dipende dall’età e dalla precedente capacità funzionale.  Quindi, l’attivazione tessuto-specifica dell’espressione di Foxn1 potrebbe compensare il difetto di rigenerazione timica e potrebbe aumentare la capacità timopoietica; infatti, quando foxn1 è espresso sotto il controllo del promotore della cheratina-14 umana eterologa, il numero di TEC aumenta e, anche se l’involuzione del timo con l’età avviene ancora, è meno pronunciata in termini assoluti.  Inaspettatamente, è stato recentemente scoperto che l’inattivazione di membri della famiglia del gene del retinoblastoma (Rb) previene l’involuzione timica; questo effetto è stato fatto risalire all’up-regolazione dell’espressione di Foxn1 attraverso i fattori di trascrizione E2F.  Questa scoperta sostiene l’idea che FOXN1 è un regolatore centrale della fisiologia delle TEC.

Rigenerazione del microambiente timico.  Alterazioni della timopoiesi come conseguenza di infezione, stress o interventi iatrogeni come chemioterapia o radioterapia, differiscono qualitativamente dai processi fisiologici su descritti (Fig. 3).  Dal momento che ciò è particolarmente rilevante da un punto di vista clinico, è stato dedicato molto lavoro per acquisire una migliore comprensione dei meccanismi di rigenerazione timica e per sviluppare strategie per riaggiustare la normale timopoiesi dopo questo tipo di insulti.  A parte quelle appena menzionate, sono note molte altre condizioni che influenzano in numero delle TEC nel timo e sono state studiate per il loro effetto sul recupero del timo dopo il danno.  Per esempio, sono stati osservati effetti benefici sul compartimento epiteliale dopo esposizione a FGF7 (noto anche come KGF), insulin-like growth factor 1 (IGF1) e WNT4, e dopo il blocco del segnale del transforming growth factor-β (TGF-β).

                Si sa bene che l’infezione ha un effetto negativo sulla funzione timica.  Un regolatore cruciale di questo processo è il microRNA miR-29a, che diminuisce la sensibilità dell’epitelio timico all’interferon-α (IFNα) indotto dall’infezione, attraverso la down-regolazione del recettore IFNα.  E’ possibile che anche l’attivazione dell’inflammasoma contribuisca all’atrofia timica indotta dall’infezione e può perfino avere un ruolo nel processo fisiologico di invecchiamento.

                Un recente rapporto ha descritto il meccanismo attraverso cui si può ottenere la rigenerazione dopo una dose sub-letale di irradiazione totale del corpo.  L’interleuchina-23 (IL-23) espressa da cellule dendritiche radio-resistenti ha stimolato le cellule induttrici di tessuto linfoide (LTi) timico radio-resistente ad esprimere IL-22, che a sua vota ha promosso la sopravvivenza delle TEC ed ha indotto la loro proliferazione.  Nonostante che questi risultati indichino che le cellule ematopoietiche stimolano la rigenerazione timica in questo modello, non è chiaro quali tipi di progenitori TEC – cioè, i progenitori TEC bipotenti o i progenitori specifici di compartimento – siano la sorgente del riempimento  dovuto alle TEC.  Sembra che il numero dei progenitori TEC sia determinato precocemente durante lo sviluppo, come indicato dal fenomeno dei topi chimerici.  La linfopenia persistente che si osserva in pazienti con displasia timica e dopo timectomia parziale indica che il compartimento stromale del timo abbia un potenziale limitato per la crescita compensatoria in assenza di danno; al contrario, la citoablazione delle TEC determina una robusta rigenerazione, il chè indica che il compartimento stromale si può comportare diversamente durante il mantenimento e la riparazione.  Nonostante ciò, una rigenerazione intermittente può depletare il gruppo delle cellule progenitrici ad un velocità maggiore rispetto al normale e, quindi, può in ultima analisi accelerare l’involuzione fisiologica (Fig. 3).  Questa ipotesi non è stata ancora studiata.

                L’inattivazione della via di segnale del TGFβ nelle TEC accelera il recupero dopo il condizionamento mieloablativo, il chè suggerisce che l’IL-22 ed il TGFβ potrebbe stimolare due vie opposte di segnale che regolano l’entità della rigenerazione dopo l’insulto timico.  Inoltre, sembra anche che il segnale del TGFβ limiti la proliferazione delle TEC.  E’ interessante notare che aumentare il segnale dell’IL-22 ha poco effetto sullo stato stazionario della timopoiesi, mentre il segnale di FGF7 aumenta il ritmo della proliferazione TEC sia allo stato stazionario che dopo insulto timico.  Quindi, sembra che il recupero timopoietico di lunga durata possa essere supportato al meglio fornendo una combinazione di IL-22 e FGF7, insieme al blocco del TGFβ.  Dal momento che l’ablazione degli ormoni sessuali non altera il compartimento stromale, non è chiaro se questa strategia potrebbe avere effetti positivi a lungo termine in questo contesto.

Quando interferire con la funzione timica

In molte situazioni cliniche, è altamente desiderabile sostituire una funzione timica fallimentare: nell’agenesia timica (per esempio, nella sindrome completa di Di George) e nei casi di deficienza di FOXN1, il trapianto di timo si è dimostrato molto efficace.  Tuttavia, quando si interferisce con il fisiologico – cioè, in relazione all’età – declino della funzione timica, devono essere prese delle cure particolari.  Come già menzionato, potrebbe essere necessario essere particolarmente prudenti nell’equilibrare il numero dei progenitori emopoietici con le dimensioni del microambiente epiteliale timico per evitare conseguenze negative come la trasformazione leucemica delle cellule T o l’autoimmunità.  Tuttavia, non è ancora chiaro come si possa ottenere tale coordinazione.

Prospettiva

Nonostante i progressi incoraggianti, non è ancora possibile ottenere miglioramenti a lungo termine e fisiologicamente rilevanti nella funzione timica attraverso interventi farmacologici.  Allo stesso modo, nonostante siano conosciute un certo numero di alterazioni genetiche che alterano o beneficiano la funzione timica, non è stato ancora possibile integrarle in una cornice coerente con un valore predittivo per un effetto benefico.  In futuro, sarà forse possibile generare tessuto epiteliale timico in vitro e sfruttare cellule staminali epiteliali residenti nel tessuto per la rigenerazione timica e/o la sua sostituzione.  Sfruttare cellule staminali epiteliali residenti nel tessuto per la sostituzione timica è ostacolato dalla nostra mancanza di conoscenze concernenti l’identità di progenitori TEC bipotenti e di cellule intermedie specifiche per compartimento.  Come conseguenza della mancanza di strumenti analitici, non si sa nulla sul numero e la cinetica di questi tipi cellulari durante il mantenimento tessutale e dopo il danno.  Quindi, rimane non chiarito se sia più probabile ottenere miglioramenti clinicamente utili nei casi di disfunzione timica con strategie che mirano a riprogrammare i tipi cellulari non affini in vivo ed in vitro verso un destino timopoietico o attivare cellule staminali quiescenti.  Alcune delle domande che non hanno trovato risposta nella biologia del timo sono affrontate nel Box 2 e potrebbero guidare la ricerca futura.

Box 1.  Differenziazione delle TEC

Il numero delle cellule epiteliali timiche (TEC) inizialmente aumenta e poi diminuisce lentamente con l’età.  Si pensa che le TEC differenziate abbiano un’emivita di circa 3 settimane (vedi la figura, parte a).  Le cellule staminali TEC (cellule verdi) emergono durante l’embriogenesi e si differenziano in TEC mature (cellule blu scuro), o direttamente o attraverso progenitori intermedi già indirizzati (cellule blu chiaro; vedi la figura, parte b).  Come conseguenza della continua generazione di TEC differenziate da cellule indifferenziate, il gruppo di precursori viene gradualmente depletato, a meno che non si auto-rigenerino.  La perdita di TEC può essere compensata da almeno due meccanismi principali (non mutualmente esclusivi) (vedi la figura, parte c): da cellule staminali attive (punteggiate di verde nel pannello superiore; si noti che senza auto-rigenerazione, il compartimento delle cellule staminali si depleta progressivamente); o da progenitori attivi indirizzati (cellule punteggiate di blu scuro nel pannello in basso; in questo caso, il gruppo delle cellule staminali è influenzato molto di meno).   

Boehm box 1

Box 2.  Problemi non risolti nella biologia del timo

Come discusso nel testo, rimangono un certo numero di problemi non risolti nella biologia delle cellule epiteliali timiche (TEC), ed alcuni di questi sono elencati di seguito.

L’espressione di Foxn1 nell’epitelio faringeo determina il destino timico e, se è così, quali sono i co-fattori endodermici specifici?

 Le strategie che mirano a riprogrammare  tessuti non affini verso ambienti timopoietici richiedono che i geni che firmano la timopoiesi siano conosciuti; di particolare importanza sono gli studi che mirano ad identificare i segnali che danno inizio all’espressione di forkhead box protein 1 (Foxn1) in regioni specifiche dell’endoderma faringeo.  In questo contesto, sarà anche importante identificare i fattori che mantengono l’espressione di Foxn1 nelle TEC; ciò aiuterà a chiarire i meccanismi che sono alla base del declino correlato con l’età dell’espressione di Foxn1.

Quali segnali inducono la differenziazione delle cTEC e delle mTEC dal precursore bipotente?

Dal momento che non è stato ancora dimostrato un gene singolo o una singola via di segnale che blocchi efficacemente lo sviluppo o della linea delle TEC corticali (cTEC) o la linea delle TEC midollari (mTEC)(anche se la loro differenziazione può essere alterata con vari mezzi), dovrebbero essere esperiti tentativi di interferire simultaneamente con più di un componente delle presunte reti genetiche specifiche per le TEC con l’obiettivo di determinare il meccanismo della differenziazione della linea.

Qual è il fenotipo dei progenitori TEC bipotenti e di quelli  specifici di compartimento e si autoreplicano ?

Il progresso è ostacolato dalla scarsezza di reagenti adatti all’identificazione ed alla purificazione delle diverse sottopopolazioni di TEC.  Questo potrebbe essere superato con lo sviluppo crescente di gruppi di promotori da usare per rifinire la tracciabilità spaziale e temporale della linea, coinvolgendo possibilmente sistemi multicolore di marcatura cellulare.  Sono particolarmente necessari strumenti che affrontino specificamente il rudimento timico prima della comparsa dell’espressione di Foxn1 e dei compartimenti cTEC ed mTEC.  Ci si aspetta che l’analisi comparativa dei quadri di espressione usando TEC da molteplici specie guidino la priorità dei candidati negli sforzi per questi marcatori di linea.  Le sottopopolazioni delle TEC potrebbero eventualmente essere purificate e caratterizzate funzionalmente in colture organotipiche in vitro (che devono essere ancora sviluppate per le cTEC) o dopo il trapianto in adatti recipienti animali.

I progenitori TEC sono eterogenei?

E’ stato mostrato che in molti sistemi sperimentali c’è una gerarchia tra cellule staminali che proliferano lentamente e progenitori indirizzati che proliferano più rapidamente.  Per esempio, nella cute, progenitori indirizzati assicurano il mantenimento del tessuto; tuttavia, dopo un danno, cellule staminali a lenta proliferazione vengono indotte a proliferare rapidamente, ma successivamente rientrano in uno stato di quiescenza.    In altri compartimenti epiteliali, questa gerarchia non esiste e lo stesso tipo di popolazione di progenitori influenza sia il mantenimento che la riparazione tessutale.  Non è chiaro a quale modello aderisca il comportamento delle TEC.

Qual è il gruppo minimo di fattori che definisce una cellula epiteliale corticale o midollare?

Tentativi precedenti di ricostituire le funzioni timopoietiche in vivo devono essere complementati per ottenere almeno lo sviluppo di cellule T γδ e l’espressione di molecole MHC per la selezione positiva e negativa.  Sarebbe anche interessante ricostituire funzioni chiave dell’epitelio midollare, per esempio, attraverso la provvigione del lymphotoxin-β receptor, RANK ligand e CD40 ligand.  In totale, questi sforzi potrebbero convergere per identificare le necessità delle nicchie per diverse sottopopolazioni di cellule T in sviluppo.

I modelli matematici possono riassumere le dinamiche di sviluppo del compartimento TEC?

Al momento, le difficoltà tecniche che si associano all’isolamento delle TEC ostacolano la valutazione quantitativa di questo compartimento; c’è bisogno di nuovi strumenti analitici per generare dati adatti ai modelli.  Questi sforzi potrebbero portare ad un apprezzamento migliore delle dinamiche dei progenitori e potrebbero guidare le strategie per rigenerare la capacità timopoietica, o manipolando l’insieme dei progenitori quiescenti o per riprogrammare tipi cellulari non affini.

Quali sono i meccanismi alla base delle modificazioni stagionali nelle proprietà ematopoietiche del timo?

In alcuni uccelli, “modificazioni stagionali” delle proprietà ematopoietiche del timo significano che l’organo cicla tra funzioni linfopoietiche ed eritropoietiche.  Questi casi estremi suggeriscono che i ritmi biologici (forse perfino su scala circadiana) possano avere un ruolo più importante nel regolare lo sviluppo e le funzioni di cellule del sistema immune rispetto a quanto si pensasse in precedenza.  Non si sa essenzialmente nulla sullo stato di organi linfoidi degli animali ibernanti, anche se sarebbe interessante sapere se questi lunghi periodi di inattività influenzano, per esempio, il processo di involuzione timica.

L’entità della produzione di cellule T nel timo è influenzata dal numero delle cellule T periferiche?

È un fatto ben stabilito che, in condizioni di linfopenia, le cellule T periferiche vanno incontro a proliferazione omeostatica.  Non è chiaro se la produzione delle cellule T nel timo possa essere regolato in accordo al numero dei linfociti periferici.  Per esempio, è ragionevole che la competizione per lo spazio delle nicchie nello spazio perivascolare (che funzione da zona di transito tra il sangue periferico ed il parenchima timico) abbia un ruolo nella regolazione dell’entrata dei precursori nel timo.   

(Tratto da Thomas Boehm e Jeremy B. Swann “Thymic involution and rigeneration: two sides of the same coin?”, Nat Rev Immunol, 2013; 13:831-838)

Anatomia dell’irrequietezza

Posted in libri with tags , , , , on February 24, 2014 by Domenico Delfino

Luca Pancrazzi(Tratto da Luca Pancrazzi, Dittico, 2002 “Nanatomia dell’irrequietezza” a cura di Luca Beatrice; DAMIANI, Palazzo della Penna, Perugia , 30 settembre 2007 – 6 gennaio 2008)

Immunità nella vecchiaia: il ruolo del timo

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on February 18, 2014 by Domenico Delfino

Introduzione

Le attuali proiezioni indicano che nei prossimi 10 anni il numero di persone al di sopra dei 65 anni supererà I bambini con meno di 5 anni.  In termini globali, è stato stimato che l’attuale numero di individui sopra i 65 anni è appena sopra i 500 milioni, cioè circa il 7% della popolazione, ma da qui al 2040 ci si aspetta che questa popolazione salga di altri 12 milioni.  Questo slittamento demografico, in parte dovuto ai successi degli avanzamenti medici, porta con sé un certo numero di sfide difficili.  Uno di questi problemi deriva dal fatto che il sistema immune si deteriora con l’avanzare dell’età aumentando la suscettibilità di un individuo alle infezioni, autoimmunità ed alcuni tumori.  Questo stato, chiamato spesso “immunosenescenza”, è associato all’incapacità di montare una risposta immune efficace ed è probabilmente universale nelle persone, anche se la sua insorgenza non avviene in un momento ben definito.  Un istigatore chiave del deterioramento dell’immunità è considerato l’atrofia del timo, che anche se è apparentemente pre-programmata, è irregolare nella propria genesi.  Inoltre, l’interazione sottile ed intricata tra il timo e l’insieme delle cellule T in periferia nel periodo post-natale influenza la tempistica dell’inizio dell’immunosenescenza.  L’inversione dell’atrofia timica può fornire una via per invertire alcuni aspetti dell’immunosenescenza, ma dovrebbe richiedere un esame che utilizzi un numero minimo di parametri per determinare se un soggetto potrà beneficiare di questa terapia.

Il timo e l’insieme delle cellule T periferiche

Il timo è un organo bi-lobato situato nel mediastino anteriore alla base dei grandi vasi e al di sopra del cuore.  L’analisi istologica rivela che in individui giovani ciascun lobo è suddiviso in lobuli e ciascun lobulo contiene una regione esterna densamente ripiena di timociti immaturi, chiamata corticale, ed una regione centrale di cellule più mature, chiamata midollare.  La corticale e la midollare insieme comprendono lo spazio epiteliale timico.  Questa è la sede dello sviluppo delle cellule T dove i progenitori provenienti dal midollo osseo si differenziano per divenire timociti immaturi che maturano in timociti prima di emigrare in periferia come nuove cellule T.  Questo spazio declina con l’età determinando una riduzione della produzione di cellule T.

                Le cellule T appena prodotte (emigranti timici recenti) entrano nell’insieme delle cellule T periferiche e circolano attraverso l’organismo, soprattutto negli organi linfoidi secondari (per es., milza e linfonodi).  Il loro incontro con uno specifico patogeno porta all’attivazione, all’espansione clonale ed alla generazione di cellule effettrici.  Un risposta di successo delle cellule T porta ad una riduzione della carica del patogeno, una diminuzione delle dimensioni del clone e la generazione delle cellule della memoria.

                E’ stata effettuata una stima delle dimensioni dell’insieme delle cellule T periferiche in base al numero delle cellule T nel sangue.  Si stima che un individuo normale di 70 kg abbia 5 l di sangue di cui ciascun µl contiene circa 1.5 x 103 cellule T, il chè indica un numero complessivo di 7.5 x 109 cellule.  Si pensa che il sangue contenga il 2% circa dell’insieme totale delle cellule T, e ciò implica che l’insieme delle cellule T periferiche in un individuo normale è all’incirca dell’ordine di 3.75 x 1011 cellule.  Il risultato sorprendente, alla luce del ritmo con cui gli individui si confrontano con gli antigeni, è che il numero di cellule T nell’insieme delle cellule T periferiche si mantiene assolutamente stabile lungo tutta la durata della vita.  Ciò suggerisce che le dimensioni dell’insieme sono controllate da meccanismi che coinvolgono la disponibilità delle nicchie, i controlli della capacità replicativa della cellula T e dalla disponibilità di fattori di sopravvivenza.

L’immunità durante tutta la vita

L’obiettivo primario delle vaccinazioni è di fornire una protezione individuale da potenziali patogeni attraverso l’induzione dell’immunità.  E’ meno probabile che gli individui protetti dalle infezioni con la vaccinazione siano una sorgente di infezione per altre persone, cosicchè anche le persone non vaccinate avranno dei benefici.  Molti schemi di vaccinazione suggeriscono un approccio fasico di induzione dell’immunità più precocemente possibile lungo il corso di vita e poi, se necessario, un richiamo quando gli individui diventano più vecchi.

                Come conseguenza del nostro incontro giornaliero con potenziali patogeni, se invecchiamo dobbiamo aver combattuto molti patogeni e esser passati attraverso molti ambienti ricchi di antigeni.  Poiché qualsiasi risposta di successo che noi mettiamo in atto genera memoria immunologica in forma di cloni di linfociti T e B con specificità definite, la nostra memoria immunologica dovrebbe aumentare con l’invecchiamento e la nostra immunità dovrebbe andare migliorando sempre di più.  La sopravvivenza fino a 90 anni dovrebbe essere associata con la presenza di una prodigiosa banca di cellule T e B della memoria, che dovrebbe fornire una risposta protettiva rapida.  Se la teoria è corretta, un individuo di questa età è più che probabile che abbia già incontrato uno specifico patogeno e dovrebbe avere cellule della memoria pronte a combatterlo.  C’è qualche evidenza di ciò?

                Gli studi sull’influenza suggerirebbero qualche sostegno a questa idea.  Uno studio recente sulle risposte di un gruppo di soggetti più vecchi (tra i 91 e i 100 anni), che sono stati probabilmente esposti al virus dell’influenza durante la pandemia del 1918 attraverso un membro malato della propria famiglia, ha trovato che tutti i soggetti avevano ancora attività serica neutralizzante contro il virus del 1918.  E’ stato misurato che l’emivita degli anticorpi nell’organismo sia dell’ordine di settimane, e ciò suggerisce che la presenza di anticorpi neutralizzanti presenti in questi individui fosse dovuta o alla presenza di plasmacellule a lunga vita o di cellule B della memoria che si differenziavano in plasmacellule e che quindi secernevano l’anticorpo specifico.  Alcune spiegazioni sulla presenza di queste cellule è stata fornita indirettamente da un rapporto sull’induzione di anticorpi dell’influenza A (H1N1) in seguito alla recente esplosione di questo virus in Messico e negli USA.  I problemi per produrre un vaccino verso un nuovo virus H1N1 in un periodo limitato di tempo ha sollevato la domanda sul fatto se la protezione potesse essere fornita dal vaccino dell’influenza stagionale usato negli anni precedenti.  Nel corso degli esperimenti, sono stati analizzati campioni di siero conservati raccolti da diversi gruppi di età durante precedenti studi sui vaccini.  I risultati hanno rivelato che gli anticorpi con reattività crociata erano rilevabili in circa un terzo dei soggetti con più di 60 anni.  Mentre la vaccinazione con vaccino per l’influenza stagionale nei bambini non esprimeva una risposta anticorpale con reattività crociata verso il nuovo virus dell’influenza A (H1N1), quegli adulti vaccinati con un vaccino stagionale mostravano un aumento di due volte del titolo anticorpale.

                Il concetto del “peccato originale antigenico” si riferisce alla capacità del sistema immunitario di utilizzare la memoria immunologica basata su una infezione precedente quando si viene in contatto con una seconda versione del virus o del batterio leggermente diversa.  Lavori precedenti hanno dimostrato che esistono risposte cellulari a reattività crociata verso ceppi diversi di influenza.  Questo concetto potrebbe spiegare la presenza di anticorpi verso il nuovo virus dell’influenza H1N1 presenti nei soggetti più anziani ed indicherebbe che l’età non è sempre un fattore negativo quando si parla di immunità.

                Tuttavia, questo miglioramento associato all’età può non essere universale verso tutti i patogeni e può non riguardare tutti i casi di influenza.  L’infezione con influenza nella vecchiaia è spesso associata a polmonite ed aumentato rischio di mortalità o può portare a complicazioni gravi così come a perdita irreversibile della condizione fisica e conseguente disabilità per una prolungata permanenza a letto con concomitante perdita di tessuto muscolare ed osseo.  Questa apparente aumentata suscettibilità all’infezione può non essere attribuibile al fallimento della vaccinazione individuale.  Le evidenze adesso suggeriscono che la vaccinazione contro l’influenza negli anziani possa non essere così efficace come nei giovani, con uno studio che suggerisce che l’efficacia è del 70-90% negli individui giovani, ma è ridotta al 30-40% in quelli al di sopra di 65 anni.  Il fallimento da parte del vaccino dell’influenza di determinare una efficacia piena negli anziani è anche una caratteristica di altri vaccini tra cui il vaccino per l’epatite B.  In uno studio in cui 45 anziani sani (con una media di 74 anni)  e 37 controlli giovani (media di 28 anni) sono stati vaccinati per l’epatite B, tutti i soggetti giovani hanno sviluppato un titolo protettivo in paragone a solo il 42% della coorte di anziani.

Le risposte alla vaccinazione non sono i soli indicatori che il sistema immune è in declino.  I clinici riconoscono che gli individui più anziani hanno spesso delle difficoltà ad affrontare i patogeni che hanno precedentemente sconfitto.  Problemi comuni includono riattivazione del virus herpes zoster o la risposta  al citomegalovirus e un aumento della gravità delle infezioni.  Inoltre, il deterioramento con l’età della risposta immune  può essere anche associato all’aumento della prevalenza di alcune forme di tumore.  Per esempio, uno studio che ha analizzato un numero di pazienti anziani ha rivelato che negli individui con un tumore originato dalle cellule B in cui l’età mediana di insorgenza era 71 anni, c’era un legame con l’infezione con il virus herpes 4.  Ciò ha portato gli autori a suggerire che questa malattia era legata al declino associato all’età nel controllo delle infezioni virali.

Universalità dell’immunosenescenza

I cambiamenti graduali nelle risposte immuni che avvengono con l’età portano allo sviluppo di uno stato di immunosenescenza, un termine onnicomprensivo ma piuttosto impreciso usato per descrivere un’incapacità a produrre una risposta immune efficace.  Le cellule T, che sono centrali nella risposta immune adattiva, vengono prodotte attraverso la differenziazione graduale di cellule staminali in linfociti funzionali e tutti gli stadi di questa via differenziativa possono essere visualizzati in individui giovani.  Questo processo di produzione linfocitaria e la conseguente generazione di cellule naive e poi della memoria può procedere solo in una direzione, cosicchè ogni duplicazione cellulare porta le cellule figlie sempre più vicine  al punto del limite replicativo.  I cambiamenti con l’età dell’ambiente degli organi linfoidi primari portano ad un declino delle funzioni ed ad una riduzione del numero delle cellule naive.  I meccanismi omeostatici assicurano che il numero delle cellule nel compartimento periferico rimanga lo stesso attraverso la proliferazione indotta delle cellule che costituiscono quel compartimento.  Questo porta a sua volta all’accumulo delle cellule ad uno stadio più tardivo della via differenziativa.  Ciò è facile da comprendere per il braccio delle cellule T dove la vecchiaia è associata con la perdita dei timociti, gli stadi precoci dello sviluppo delle cellule T nel timo, un declino del numero dei linfociti T naive ed un aumento nel numero delle cellule effettrici terminali, soprattutto della linea CD8.  Molte di queste cellule hanno l’apparenza fenotipica di cellule senescenti.  Le cellule senescenti, situati come sono alla fine del loro ciclo replicativo, non hanno capacità proliferativa e quindi non hanno la capacità di espandersi clonalmente quando incontrano un potenziale patogeno.  Un individuo con un grande numero di cellule senescenti può non essere più completamente protetto dalle possibili conseguenze di un’infezione.

Inversione dell’atrofia timica: Una possibile terapia per l’immunosenescenza

Il nostro lavoro suggerisce che appena il timo si atrofizza c’è un declino misurabile nella fuoriuscita di cellule T verso il compartimento delle cellule T naive e che lo spazio immunologico lasciato dalla diminuzione del numero delle cellule T naive è riempito dalla proliferazione di altre cellule T nel compartimento.  La nostra ipotesi è che il declino dell’immunità sarebbe alleviato se l’atrofia timica potesse essere invertita.  Abbiamo mostrato che c’è una riduzione associata all’età dei livelli di interleuchina(IL)-7 nel microambiente timico, che porta ad una riduzione della sopravvivenza dei timociti in stadi precoci delle vie di sviluppo delle cellule T e ciò produce una riduzione nel numero dei timociti più maturi.  La conseguenza è l’atrofia timica e la ridotta fuoriuscita dal timo.  In esperimenti esploratori abbiamo dimostrato che il trattamento di topi vecchi e primati vecchi con IL-7 ricombinante inverte l’atrofia timica, aumenta la funzionalità timica e conseguentemente migliora le risposte immunitarie.

Il saggio TREC

Nonostante che l’inversione dell’atrofia timica appaia una opzione possibile, una delle sfide che ci vengono poste è determinare quali individui potrebbero beneficiare al massimo di questo trattamento.  TREC (T-cell receptor excision circles) sono dei piccoli DNA circolari escissi dal genoma durante la produzione di cellule T αβ+.  Non si replicano con la cellula e quindi appena la cellula T si divide i TREC passano in una sola delle cellule della progenie.  I TREC sono quindi al loro massimo livello in una popolazione di cellule che contiene molti emigranti timici recenti.  Se assumiamo che non c’è perdita di TREC per degradazione del DNA, il declino dei valori di TREC con l’età nel compartimento delle cellule T periferiche deve avvenire con la proliferazione delle cellule T in costituzione  insieme al declino della funzionalità timica.  Il punto è se c’è una frequenza di TREC che sia indicativa di scarse risposte immuni.  Nonostante che lo stato di immunosenescenza possa essere dovuto alla mancanza di cellule T naive o alla presenza di popolazioni ingrandite clonalmente, è forse possibile usare la frequenza di TREC come marcatore surrogato e quindi identificare gli individui che trarrebbero i maggiori benefici dalla terapia di ringiovanimento immune.    

(Tratto da R. Aspinall, D. Pittis, A. Lapenna e W. Mitchell “Immunity in the Elderly: The Role of the Thymus”, J. Comp. Path. 2010, Vol. 142, S111 eS115)

Il doping

Posted in libri with tags , , , , on February 10, 2014 by Domenico Delfino
Le condotte costituenti reato: somministrazione ed assunzione di sostanze dopanti

“…La preoccupazione di non dilatare eccessivamente la responsabilità penale dell’atleta ha spinto il legislatore ad abbandonare un’opzione sanzionatoria che era invece prevista dalla legge n. 1099/71.  Le norme della legge 376 – a differenza della precedente normativa – non prevedono infatti alcuna sanzione penale per l’ipotesi dell’atleta che rifiuti di sottoporsi ai controlli anti-doping…”

(Tratto da Stefano Rufini “Il Doping – note a margine – …in ricordo di Ruggero Rossi”; Università degli Studi di Perugia, 2008)

Glucocorticoidi

Posted in Farmaci in Odontoiatria with tags , , on February 3, 2014 by Domenico Delfino

I glucocorticoidi sono ormoni secreti dalla giandola surrenale in risposta a ritmi ultradiani e circadiani e allo stress.  I principali effetti dei glucocorticoidi possono essere largamente definiti come modulatori del metabolismo dei carboidrati, proteine e metabolismo lipidico, così come dell’equilibrio idro-salino.  Di conseguenza, i glucocorticoidi sono coinvolti nella deposizione del glucosio come glicogeno e nella conversione di glicogeno e proteine in glucosio quando necessario; la stimolazione della perdita di proteine in organi specifici; la redistribuzione di tessuto adiposo nelle regioni facciali, addominali e spalle; e nell’alterazione del ritmo di filtrazione di specifici elettroliti che causano ritenzione d’acqua.

                I glucocorticoidi regolano principalmente le vie metaboliche, mentre i mineralcorticoidi sono coinvolti nell’equilibrio idro-salino.  La secrezione dei glucocorticoidi da parte della ghiandola surrenale è controllata da ormoni, come il fattore di rilascio della corticotropina, prodotto dall’ipotalamo, e l’ormone adrenocorticotropo (ACTH), prodotto dall’ipofisi anteriore.  Questa via è spesso chiamata asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA).  La secrezione dei glucocorticoidi da parte della ghiandola surrenale è regolata da un meccanismo a retroazione negativa; cioè, la ghiandola surrenale diminuisce la secrezione di glucocorticoidi quando sono presenti eccessivi livelli plasmatici di steroidi.  Tuttavia, la ghiandola non riesce a distinguere tra glucocorticoidi endogeni o somministrati esogenamente.  Di conseguenza, la somministrazione di livelli soprafisiologici di glucocorticoidi esogeni per periodi lunghi può determinare una insufficienza surrenalica secondaria.

I glucocorticoidi, tra le altre cose, sono essenziali per la capacità della persona ad adattarsi a situazioni stressanti.  Una disfunzione o insufficienza surrenalica può, quindi, predisporre una persona ad inadeguata risposta fisiologica allo stress.  Una severa soppressione surrenalica e la risposta diminuita allo stress che ne è associata può avere significato clinico dopo 7-10 giorni di somministrazione dello steroide.  In situazioni stressanti, ne può conseguire collasso cardiovascolare,  che, se non trattato appropriatamente, può portare ad un elevato grado di morbidità e perfino a morte.  Questo tipo di risposta è rara in pazienti con insufficienza surrenalica da glucocorticoidi esogeni, ma può essere una preoccupazione per pazienti con malattia di Addison.  I dentisti devono essere in grado di valutare il livello di soppressione della ghiandola surrenalica e fornire al paziente terapia sostitutiva con glucocorticoidi quando è necessario.

Valutazione della soppressione surrenalica.  Molti fattori giocano un ruolo nel valutare la diminuita secrezione dei glucocorticoidi dalla ghiandola surrenalica in pazienti a cui sono stati prescritti i glucocorticoidi.  Questi fattori includono, ma non sono limitati a, il tipo di glucocorticoide prescritto al paziente, la via di somministrazione, la posologia, la durata del trattamento con steroide, disordini sistemici concomitanti ed interazioni farmacologiche.

A ciascun tipo di formulazione dei glucocorticoidi è stato assegnato uno specifico livello di potenza che viene paragonato alla potenza dell’idrocortisone (Tabella 5.1).  Quindi, il prednisone è 5 volte più potente dell’idrocortisone, mentre il betametasone è 25 volte più potente.  Più il farmaco è potente, più alto è il rischio che possa causare soppressione surrenalica.  Il rischio di insorgenza di effetti avversi da somministrazione di glucocorticoidi di solito aumenta con la durata della terapia e con la frequenza delle somministrazioni.

Indicazioni accettate

I glucocorticoidi sono usati per indurre soppressione immune in pazienti con una varietà di condizioni.  Ai pazienti che hanno subito un trapianto d’organo, per esempio, spesso vengono prescritte alte dosi di glucocorticoidi per prevenire il rigetto dell’organo.  Nonostante che anche altre condizioni come malattie autoimmuni, malattie respiratorie, malattie dermatologiche, ed alcuni disordini ematologici richiedano una terapia a lungo termine con glucocorticoidi, di solito non servono dosi così alte come quelle usate nei pazienti trapiantati.

                I glucociorticoidi sono usati anche in situazioni dentali.  Diverse condizioni orali come il lichen planus, le ulcere aftose, il penfigoide mucomembranaceo benigno, il penfigo, la neuralgia posterpetica, ed i disordini dell’articolazione temporo-mandibolare beneficiano della terapia glucocorticoidea.  Inoltre, i glucocorticoidi sono usati anche per ridurre il gonfiore dopo procedure chirurgiche orali-maxillofacciali maggiori.

Informazioni Generali di Dosaggio

La tabella 5.1 fornisce dosaggi ed informazioni di prescrizione per glucocorticoidi sistemici (divisi in categorie a bassa, media ed elevata potenza); glucocorticoidi topici (divisi in categorie a bassa, media, alta e molto alta potenza); e glucocorticoidi inalatori.

Quando somministrano i glucocorticoidi, i dentisti possono usare formulazioni topiche, iniezioni intralesionali ed intra-articolari, o forme sistemiche.  Gli agenti topici sono i più frequentemente usati dai dentisti e, se usati per meno di 1 mese, di solito non causano effetti deleteri significativi.  Tuttavia, glucocorticoidi topici a potenza molto elevata usati per trattare condizioni orali possono causare soppressione surrenalica e non dovrebbero essere usati per più di 2 settimane senza una attenta valutazione medica del paziente.  Pomate, linimenti e gel possono tutte essere usate intraoralmente e vengono applicate sulle lesioni 2-4 volte al giorno.  I gel aderiscono abbastanza bene alla mucosa orale  e vengono applicati direttamente sulle lesioni.  Per aumentare la penetrazione ed il tempo di contatto  con le lesioni, le formulazioni in gel possono essere poste all’interno di un protettore della bocca che copre l’area affetta.  Le pomate di solito sono mischiate con una quantità uguale di Orabase , un composto che aderisce alla mucosa orale, ed è apposto direttamente sulle lesioni.  Le pomate possono essere apposte anche all’interno di protettori della bocca.  Nonostante le creme possano essere usate per lesioni orali, queste formulazioni non sono usate comunemente per questi scopi.  L’elisir di desametasone e lo sciroppo di prednisolone sono i colluttori orali usati comunemente per scopi topici.  Il paziente viene istruito a risciacquare per 30 secondi con questi medicamenti, e poi ad espettorarli, 2-4 volte al giorno.

                Le iniezioni intralesionali comunemente sono usate solo intermittentemente ; quando vengono usate per patologie dei tessuti molli, non sono state associate a complicazioni sistemiche.  Il triamcinolone esacetonide è il medicamento più frequentemente usato a questo scopo.

                Le iniezioni intra-articolari, anche quelle effettuate prevalentemente con triamcinolone esacetonide, dovrebbero essere effettuate solo con intervalli di 3 settimane per diminuire la patologia ossea.

                La terapia glucocorticoidea sistemica è usata a breve termine prima, durante e dopo chirurgia orale per ridurre l’edema post-operatorio.  Le lesioni orali associate a morbidità molto alta sono talvolta trattate con terapia glucocorticoidea sistemica.  Dosi elevate di prednisone, fino a 60-80 mg al giorno per 7-10 giorni, possono essere usate per il trattamento del lichen planus, delle maggiori ulcerazioni aftose, del pemfigoide e del penfigo orale.  Trattamenti oltre le 2 settimane dovrebbero essere coordinati con il medico del paziente.    

Dosi Massime Raccomandate

Le dosi massime raccomandate per le formulazioni di glucocorticoidi sistemici per procedure o visite sono 5-20 mg di prednisone per una dose di mantenimento e 5-60 mg per una terapia continua o a giorni alterni, ma le dosi dipendono dalle condizioni del paziente.  La posologia e le dosi massime sono basate sull’assunto che il dentista abbia determinato (attraverso la rilevazione della storia sanitaria ed il colloquio) che il paziente sia in buona condizione generale di salute e non stia prendendo alcun medicamento che possa interagire con l’agente glucocorticoideo.  La preoccupazione principale è costituita da pazienti con condizioni di iperglicemia e pazienti che non possono tollerare una terapia immunosoppressiva.  I potenziali effetti dannosi di questi medicamenti devono essere sempre attentamente soppesati contro i loro benefici.

AGGIUSTAMENTI DEL DOSAGGIO

La dose massima reale deve essere individualizzata per ciascun paziente in dipendenza delle sue dimensioni, età e stato fisico; altri farmaci presi concomitantemente; e durata della terapia glucocorticoidea in corso (considerazioni per l’uso a lungo termine).  Una riduzione delle dosi massime possono essere indicate per i pazienti geriatrici e pedriatici, pazienti con malattie o disabilità gravi, e pazienti con condizioni mediche o che stanno prendendo farmaci che alterano la risposta ai glucocorticoidi.  

Specifiche considerazioni dentali

L’effetto dei glucocorticoidi può essere suddiviso arbitrariamente in due categorie che sono significative per i dentisti:

° I pazienti odontoiatrici che prendono glucocorticoidi possono avere bisogno di modificazioni ed alterazioni della terapia dentale di routine, allo scopo di ridurre la risposta del paziente allo stress e la sostituzione dei glucocorticoidi.

° Chi usa i glucocorticoidi può avere manifestazioni intraorali.

Modificazioni della terapia dentale di routine.

C’è bisogno di copertura antibiotica? Non ci sono dati definitivi a riguardo del bisogno per i pazienti che prendono i glucocorticoidi di ricevere profilassi antibiotica prima di sottoporsi a terapia dentale.  Tuttavia, è prudente per gli operatori odontoiatrici prendere in considerazione la profilassi antibiotica in pazienti che prendono una dose combinata di più di 700 mg di prednisone.  Non è raccomandata la profilassi antibiotica se un paziente prende meno di 10 mg di prednisone al giorno.  I dentisti possono scegliere di usare lo stesso protocollo per la profilassi antibiotica utilizzato dall’American Heart Association per la prevenzione dell’endocardite batterica subacuta.  Tuttavia, non è stata ancora stabilita l’efficacia di questo protocollo per pazienti che prendono glucocorticoidi.

                Ci sono due situazioni in cui i dentisti possono fornire ai pazienti una ulteriore quantità di glucocortcoidi.  Primo, i pazienti con disfunzione delle ghiandole surrenali possono non essere capaci di produrre abbastanza glucocorticoidi per rispondere allo stress associato alla terapia odontoiatrica.  La condizione più frequente associata a disfunzione della corticale del surrene è la malattia di Addison, una distruzione autoimmune delle ghiandole surrenali.  I pazienti con ghiandole surrenali inadeguatamente funzionanti avranno bisogno di terapia glucocorticoidea profilattica prima di sottoporsi a procedure dentali.  Secondo, pazienti che stavano prendendo glucocorticoidi da lungo tempo possono avere una soppressione corticosurrenale iatrogena e necessiteranno di terapia sostitutiva glucocorticoidea prima di sottoporsi a procedure odontoiatriche.

                Dal momento che la risposta allo stress finisce entro 11-14 giorni dopo l’interruzione della terapia glucocorticoidea, i pazienti non hanno bisogno di terapia sostitutiva dopo un periodo di 2-4 settimane senza assunzione di glucocorticoidi.  Inoltre, pazienti che sono passati da una terapia giornaliera ad una terapia a giorni alterni possono essere trattati senza terapia sostitutiva nel giorno senza glucocorticoidi.  Di regola, i pazienti che hanno bisogno di terapia sostitutiva dovrebbero ricevere l’equivalente di un massimo di 300 mg di idrocortisone o 60-75 mg di prednisone la mattina della visita odontoiatrica.

                L’entità della terapia sostitutiva dovrebbe essere determinata in base alla previsione del livello di stress.  In accordo a ciò, a seconda del livello di paura ed ansia del paziente, l’esame orale generalmente non richiede terapia sostitutiva, mentre qualsiasi procedura che necessita di anestetici locali vale una copertura glucocorticoidea supplementare.

                Gli operatori sanitari di cure orali dovrebbero seguire questo protocollo per la gestione di pazienti che stanno ricevendo terapia glucocorticoidea:

° Programmare procedure elettive al mattino.

° Usare sedativi blandi per pazienti apprensivi.

° Usare terapia sostitutiva glucocorticoidea quando è indicata.

° Usare sempre anestetici locali a lunga azione.

° Monitorare la pressione sanguigna durante la procedura.

° Usare medicamenti per alleviare il dolore postoperatorio.

                Di regola, la terapia sostitutiva è indicata per pazienti che stanno assumendo più di 30 mg di glucocorticoidi equivalenti all’idrocortisone da più di 2 settimane.  E’ anche indicata per pazienti che hanno bisogno di cure dentali nelle prime 2-4 settimane dopo che hanno interrotto la terapia glucocorticoidea dopo aver assunto almeno 30 mg di glucocorticoidi equivalenti a 30 mg di idrocortisone per più di 2 settimane.

                Manifestazioni Intraorali.  Di tutte le manifestazioni intraorali causate dai glucocorticoidi, la più frequente è la candidiasi orale.  E’ stato stimato che fino al 75% delle persone che assumono glucocorticoidi per inalazione possono sviluppare candidiasi intraorale (Tabella 5.1).  Questi inalatori sono usati principalmente da pazienti con asma, ma possono anche essere prescritti a pazienti con allergia ed altre condizioni respiratorie.  Per diminuire l’insorgenza di candidiasi, i dentisti dovrebbero istruire appropriatamente i pazienti sull’uso di spaziatori e di sciacquare la propria bocca con acqua dopo l’uso degli inalatori.  La risoluzione della candidiasi intraorale può essere efficacemente ottenuta con compresse, pastiglie o soluzioni orali antimicotiche.

                La somministrazione sistemica a lungo termine di glucocorticoidi può alterare la cicatrizzazione delle ferite.  Ciò può essere il risultato di effetti catabolici e della ridotta risposta infiammatoria indotta da questi composti.

                Le proprietà anti-infiammatore dei glucocorticoidi possono mascherare un’infezione cronica.  I glucocorticoidi prevengono l’accumulo dei neutrofili e dei monociti (alterata chemiotassi) e sopprimono ulteriormente le capacità fagocitiche delle cellule.  Quindi, la classica risposta infiammatoria clinica può essere molto diluita.

                E’ stata anche riportata secchezza delle fauci in pazienti che assumono glucocorticoidi, sia per via sistemica che per via inalatoria.  Può essere prevista un’aumentata frequenza di carie, ed i pazienti dovrebbero essere istruiti a migliorare le proprie procedure di igiene orale e ad usare fluoruri topici, così come terapia fluorurica al lavoro.

INTERAZIONI FARMACOLOGICHE DI INTERESSE ODONTOIATRICO

La tabella 5.2 elenca le interazioni farmacologiche dei glucocorticoidi ed i problemi correlati di potenziale significato clinico in odontoiatria.

ALTERAZIONI DEI VALORI DI LABORATORIO

° Bassi livelli di cortisolo serico, < 5-10 μg/dL in un campione ottenuto tra le 8 e le 10 del mattino, ed un aumentato livello serico di ACTH, 200-1600 μg/dL, sono diagnostici di insufficienza surrenalica.  I dentisti possono voler richiedere una completa conta delle cellule del sangue, dal momento che possono essere presenti neutropenia e linfocitosi.

PAZIENTI SPECIALI

Donne in gravidanza ed allattamento

Tutte le preparazioni di glucocorticoidi sistemici sono classificati nella categoria C di rischio della gravidanza e possono causare malformazioni tipo labbro leporino e palatoschisi.  Di conseguenza, la somministrazione di glucocorticoidi durante la gravidanza e durante l’allattamento dovrebbe essere evitata.

Pazienti pediatrici, geriatrici ed altri pazienti speciali

La somministrazione di anche solo 5 mg di prednisone può causare ritardo della crescita nei bambini.  Tuttavia, se la terapia glucocorticoidea finisce  prima della chiusura delle epifisi, la crescita può riprendere.

I pazienti pediatrici possono avere una maggiore suscettibilità rispetto agli adulti alla soppressione surrenalica indotta da glucocorticoidi topici, in quanto i bambini hanno una cute più sottile ed il loro rapporto tra la superficie corporea ed il peso corporeo è più grande che negli adulti.  I glucocorticoidi topici dovrebbero essere usati con cautela nei bambini.

I pazienti geriatrici manifestano una propensione a sviluppare ipertensione, così come osteoporosi, quando ricevono una terapia glucocorticoidea.  Il dosaggio di glucocorticoidi inoltre deve essere modificato nei pazienti più giovani e più anziani per minimizzare il danno ai reni e alle funzioni del fegato.

MONITORAGGIO DEL PAZIENTE: ASPETTI DA CONTROLLARE

° Sintomi di discrasia sanguigna (come infezione, sanguinamento e cicatrizzazione scarsa): per pazienti con questi sintomi, il dentista dovrebbe richiedere un consulto medico per esami del sangue e posporre il trattamento odontoiatrico fino a che non vengano ristabiliti i valori normali.

° Segni vitali, a tutte le visite: necessari per monitorare eventuali effetti collaterali cardiovascolari

° flusso salivare: come fattore di carie, malattia periodontale e candidiasi

° Dose e durata della terapia glucocorticoidea: per valutare la tolleranza allo stress ed il rischio di immunosoppressione

° Necessità di consulto medico: per valutare il controllo della malattia e la tolleranza allo stress del paziente

Effetti avversi e precauzioni

La molteplicità degli effetti avversi dei glucocorticoidi necessitano di una divulgazione completa dei rischi del paziente (Tabella 5.1).  La sottrazione dei glucocorticoidi dopo che i pazienti sono trattati per più di 10 giorni consecutivi dovrebbe essere ottenuta gradualmente per diminuire gli effetti collaterali.  I pazienti che prendono una dose giornaliera di 60 mg di prednisone dovrebbero ridurre la loro assunzione giornaliera di 10 mg al giorno prima di interrompere completamente la terapia.  Una interruzione troppo rapida della terapia glucocorticoidea può far esplodere le condizioni controllate fino allora o addirittura determinare una crisi surrenalica.  Se è necessario che un paziente continui a ricevere la terapia glucocorticoidea per più di 2 settimane, è appropriato consultarsi con un medico.

                Una malattia epatica severa può inibire il metabolismo del prednisone; quando questi pazienti devono essere trattati, il dentista può dover somministrare la forma attiva del medicamento, il prednisolone, per ottenere gli effetti clinici.  Inoltre, i pazienti con malattia epatica severa possono non essere in grado di prendere glucocorticoidi con il paracetamolo, dal momento che ne può conseguire tossicità da paracetamolo.

                La somministrazione concomitante di altri medicamenti come barbiturici, fenitoina e rifampina può raddoppiare la clearance del prednisolone.  Si possono avere interazioni anche con altri medicamenti che devono essere considerati quando si prescrivono glucocorticoidi (Tabella 5.2).

                I più frequenti segni avversi  della terapia glucocorticoidea includono modificazioni della cute (come acne, ecchimosi, assottigliamento, strie violacee addominali), aumento di peso, obesità centripeta, “gobba di bufalo” (accumulo di tessuto adiposo nella parte posteriore del collo), estremità assottigliate, diminuzione della massa muscolare e “facies lunare”.  Queste caratteristiche compaiono nel 13% dei pazienti dopo appena 60 giorni di utilizzazione dei glucocorticoidi e fino al 50% dei pazienti trattati per 5-8 anni.  I pazienti con questi segni devono essere incoraggiati a tenere una dieta a basso contenuti di grassi e di calorie e a fare attività sportiva.

                Fratture ossee possono avvenire nell’11-20 % dei pazienti trattati con dosi giornaliere di 7,5-10 mg di prednisone per più di un anno.  La causa principale di queste modificazioni osteoporotiche può essere una diminuzione dell’attività e della maturazione degli osteoblasti.  La perdita più rapida è quella di osso trabecolare che avviene nei primi 2 mesi di terapia glucocorticoidea a dosi elevate, con una media del 5% di perdita di massa ossea nel primo anno.  E’ prudente somministrare integratori a base di vitamina D e calcio ed ormone sostitutivo ed iniziare un programma di esercizi per sostenere pesi nei pazienti che ricevono terapia glucocorticoidea a lungo termine.  Un’altra complicazione, trovata più frequentemente in pazienti che prendono una terapia glucocorticoidea a lungo termine, è l’osteonecrosi, che colpisce specificamente l’articolazione dell’anca.

                I pazienti che assumono una dose totale di più di 1000 mg di prednisone sono più predisposti dei pazienti che prendono meno glucocorticoidi allo sviluppo di ulcera peptica.  Questo effetto collaterale è aggravato in pazienti che stanno già assumendo altri medicamenti potenzialmente ulcerogeni.  La somministrazione di antagonisti H2 può essere di beneficio come misura profilattica per ridurre l’incidenza di ulcera peptica.

                Inizialmente i glucocorticoidi possono indurre uno stato psicologico di benessere, che successivamente si può trasformare in uno stato di depressione indotta da glucocorticoidi quando i glucocorticoidi vengono interrotti.

                In pazienti con lupus eritematoso sistemico o artrite reumatoide che sono trattati con glucocorticoidi a lungo termine è stata notata un’aumentata incidenza di aterosclerosi accelerata.  Inoltre, pazienti con una preesistente ipertensione possono andare incontro ad un peggioramento del controllo della loro ipertensione quando sono trattati con glucocorticoidi.

                Una intolleranza al glucosio associata ai glucocorticoidi non è associata a complicazioni gravi, ma prudenza dovrebbe essere adottata quando si tratta di pazienti diabetici.

                E’ stato riportato la progressione del carcinoma della mammella e del sarcoma di Kaposi in pazienti che ricevono terapia glucocorticoidea.  Nonostante ci possa essere un rinnovato sviluppo del sarcoma di Kaposi, questa lesione di solito scompare con la cessazione della terapia glucocorticoidea.

Farmacologia

                Meccanismo d’azione/effetto.  L’efficacia degli ormoni glucocorticoidei si basa sulla loro capacità di legarsi al proprio recettore citosolico nei tessuti bersaglio e successivamente entrare nel nucleo, dove il complesso glucocorticoide-recettore interagisce con la cromatina nucleare.  Ciò determina una cascata di eventi che comprendono l’espressione di acidi ribonucleici specifici dell’ormone, o RNA, che a sua volta aumenta la sintesi di specifiche proteine che mediano distinte funzioni fisiologiche.  Il glucocorticoide cortisolo è un ormone normale circolante secreto dalla ghiandola surrenale che funziona nella regolazione del metabolismo normale e fornisce la resistenza allo stress.  Inoltre, a livelli elevati o come risultato di malattie o per l’assunzione di farmaco i glucocorticoidi possono avere uno o più effetti fisiologici come:

° Alterare il livello delle cellule del sangue (cioè, diminuire gli eosinofili, i basofili, monociti e linfociti e aumentare i livelli di emoglobina, eritrociti e neutrofili), che diminuiscono i livelli circolanti delle cellule coinvolte nella lotta alle infezioni e determinano quindi un’aumentata suscettibilità alle infezioni;

° Ridurre la risposta infiammatoria come risultato della diminuzione dei linfociti così come dell’alterazione della capacità dei linfociti di inibire l’enzima fosfolipasi A2, che è necessario per la produzione di prostaglandine e leucotrieni;

° Sopprimere l’asse HPA, e quindi inibire l’ulteriore sintesi di glucocorticoidi.

                Quindi, i pazienti che assumono glucocorticoidi hanno bisogno di un’attenzione speciale come discusso nell’introduzione.

                Assorbimento.  Sistemicamente, molti glucocorticoidi sono assorbiti rapidamente e prontamente dal tratto GI a causa del loro carattere lipofilo.  Inoltre, l’assorbimento avviene anche per via sinoviale e attraverso lo spazio congiuntivale.

                Topicamente, l’assorbimento attraverso la cute è molto lento.  Tuttavia, l’uso cronico sotto forma di inalazione (per riniti stagionali, per esempio) può portare ad atrofia epiteliale polmonare.  Inoltre, un uso eccessivo o prolungato di glucocorticoidi topici può determinare un assorbimento sufficiente per causare effetti sistemici.

                Sia il cortisone che il prednisone contengono un gruppo chetonico nella posizione II che deve essere idrossilato nel fegato per essere attivato.  Quindi, questi farmaci dovrebbero essere evitati in pazienti con funzione epatica anormale.  Inoltre, l’applicazione topica di chetocorticoidi in posizione II è inefficace come risultato dell’inattività di questa forma di glucocorticoide.

                Distribuzione.  In generale, il cortisolo circolante è legato alle proteine plasmatiche: l’80-90% circa è legato alla transcortina – una globulina che lega il cortisolo con alta affinità – mentre il 5-10% si lega poco saldamente all’albumina.  Circa il 3-10% rimane in forma libera (bioattiva).  La transcortina può legare anche molti glucocorticoidi sintetici.  Tuttavia, alcuni glucocorticoidi, come il desametasone, non si legano alla transcortina e, quindi, sono in forma libera per quasi il 100%.

                Biotrasformazione.  L’inattivazione avviene principalmente nel fegato ed anche nel rene, per lo più con formazione di metaboliti inattivi.  Tuttavia, cortisone e prednisone sono attivati solo dopo essere stati metabolizzati a idrocortisone e prednisolone, rispettivamente.  I glucocorticoidi fluorinati sono metabolizzati più lentamente rispetto agli altri membri di questo gruppo.

                Eliminazione.  Il 30% circa dei metaboliti inattivi sono ulteriormente metabolizzati e successivamente escreti con le urine.

Suggerimenti ai pazienti

° Enfatizza l’importanza di una buona igiene orale per prevenire l’infiammazione dei tessuti molli.

° Avverti il paziente di evitare danni quando usa aiuti per l’igiene orale; il paziente dovrebbe usare uno spazzolino morbido e lasciare che il dentista o l’igienista valuti le sue tecniche per l’uso dello spazzolino e del filo interdentale.

° Suggerisci l’uso giornaliero di preparazioni casalinghe di fluoruro se c’è una xerostomia cronica. 

° Suggerisci l’uso di gomme senza zucchero, di frequenti sorsi d’acqua o sostituti artificiali della saliva se c’è una xerostomia cronica.

° Prudenza nell’uso di colluttori con elevato contenuto d’alcool, in quanto hanno l’effetto di disidratare la mucosa orale.

° Il paziente dovrebbe usare un glucocorticoide dopo aver mangiato e spazzolato i denti prima di andare a letto per avere un effetto ottimale.

° L’uso di glucocorticoidi topici per ulcere erpetiche orali è controindicato.

° Il paziente dovrebbe applicare l’agente con un applicatore con una estremità ricoperta da cotone attraverso una pressione, non attraverso uno sfregamento, della crema sulla lesione.

° Quando si usa un glucocorticoide topico per trattare lesioni orali, ci dovrebbe essere una risposta tessutale entro 7-14 giorni.  Se ciò non avviene, il paziente dovrebbe farsi visitare di nuovo per una ulteriore valutazione.  Se i glucocorticoidi sono usati cronicamente, il paziente dovrebbe sottoporsi a frequenti visite di richiamo.

° Se intervengono irritazione, infezione o sensibilizzazione sul punto di applicazione, il paziente dovrebbe interrompere la somministrazione e sottoporsi a nuova visita.

° Il paziente dovrebbe evitare di esporre l’area colpita alla luce del sole; potrebbe andare incontro a bruciatura.

° I glucocorticoidi topici sono solo per uso esterno.

° Il paziente dovrebbe evitare che il glucocorticoide topico venga in contatto con i propri occhi.

° Il paziente non dovrebbe bendare l’area colpita a meno di precise istruzioni per farlo.

° Il paziente dovrebbe riportare gli effetti avversi.

° Il paziente dovrebbe evitare di assumere qualsiasi cosa per bocca per 30-60 minuti dopo l’uso in bocca (come colluttorio o pomata).   

(Tratto da Lida Radfar, D.D.S., M.S.; Martha Somerman, D.D.S., Ph.D. “Glucocorticoids” in “ADA/PDR Guide to DENTAL THERAPEUTICS”, fourth Edition, ADA, American DEntal Association, www.ADA.org; THOMSON PDR)

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