Dang Phuong Viet

Posted in Uncategorized with tags , on December 30, 2013 by Domenico Delfino

dang phuong viet

36 Congresso Nazionale della Società Italiana di Farmacologia

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on December 16, 2013 by Domenico Delfino

Sif Torino

Novel Src kinase inhibitors inhibit the growth of CD133+ colorectal cancer cells.

N. Pozzesi1, A.M. Liberati1, M. Botta2, D.V. Delfino1

1Dept. Clinical and Experimental Medicine, University of Perugia; 2Dept. of Biotechnologies, Chemistry and Pharmacy, University of Siena.

 

It is a cancer stem cell concept that cancer cells exhibit a hierarchy, as do normal cells, and that a small fraction of cancer cells are maintained as “cancer stem cells” that have self-renewal and differentiating abilities. Colorectal cancer (CRC) is the second most common cause of cancer-related death (after lung cancer) and, recently CRC stem cells have been identified as CD133+ CRC cells and isolated. The Src family kinases comprises nine members and among them, Src primarily has been implicated in the development of human cancer. Specifically, in colon cancer, there is a frequent elevation of cellular Src kinase activity over that observed in the adjacent normal mucosa, with activation being linked to malignant potential. Src-family kinases is also involved in stem cell functions and this identifies Src kinases as potential targets for modulating stem cell functions. Based on this background, our hypothesis is that a strong inhibition of Src kinase in CD133+ CRC cells can be beneficial for the therapy of this type of cancer. To this purpose new inhibitors of Src phosphorilation were utilized in order to study and inhibit the progression of CRC at the level of CD133+ CRC stem cells.

Decrease of HT-29 colon cancer cell number after treatment with different novel Src inhibitors.

The novel Src kinase inhibitors SI34 – SI83 – S7 – S13, from pyrazol[3,4,d-]pyrimidine derivatives, have been tested on the CD133+ HT-29 colon cancer cell line (about 98% CD133+ cells). The dose response curves have been performed by using the concentrations of 2 – 10 – 25 – 50 μM and measuring the effect in terms of total cell number after 24 and 48 hours of treatment. Whereas SI34 e SI83 are effective at concentrations of 25 μM after 48 hours of treatment, S7 e S13 are more potent since determined a decrease in cell number at lower concentrations (10 μM after the first 24 hours of treatment, with a maximum of significant decrease reached with the S13 compound.

Cell cycle analysis of S13-treated HT-29 colon cancer cells.

The cytofluorimetry analysis of HT-29 cells showed that 24 hours treatment with 10 μM S13 inhibits the progression of cell cycle. S13-treated cells undergo to a consistent apoptosis after 72 hours of treatment.

Inhibition of proliferation of HT-29 cells by S13 Src kinase inhibitor.

[3H]thymidine uptake assay demonstrated that S13 Src kinase inhibitor significantly inhibited the proliferation of HT-29 cells after 24 and 48 h of culture.

MicroRNA expression induced by S13 in HT-29 colon cancer cells.

Total RNA was extracted from untreated HT-29 human colorectal cancer cells and from cells after 6h and 12h of treatment with 10 μM of S13 and RNA quality control analysis was performed. High definition Agilent 15K miRNA microarray based on Sanger miRbase 12 was hybridised with total RNA and treated cells showed altered expression of several miRNAs. Among these, has-miR-494 displayed up-regulation in HT-29 cells after 6h of treatment with increased expression at 12h (> 2-fold).

The reported preliminary results strongly support this hypothesis since 1) the new Src inhibitors inhibited the growth of CD133+ HT-29 CRC cells; 2) they significantly promoted HT-29 apoptosis and inhibited its proliferation; and 3) One of these new Src inhibitors significantly modulated the expression of different miRNAs in HT-29 cells.

Anti-neoplatic and immunosuppressive activity of compounds isolated from the leaves of Artocarpus tonkinensis.

N. Pozzesi, C. Riccardi, D.V. Delfino

Dept. Clinical and Experimental Medicine, University of Perugia.

 

The leaves of Artocarpus tonkinensis (At) are used in Vietnamese traditional medicine for treatment of arthritis, and the compound maesopsin 4-O-β-D-glucoside (TAT-2), isolated from them, inhibits the proliferation of activated T cells.  Our goal was to test the anti-proliferative activity of TAT-2 on the T-cell leukemia, Jurkat, and on the acute myeloid leukemia, OCI-AML.  TAT-2 inhibited the growth of OCI-AML (and additional acute myeloid leukemia cells, such as U937, KG-1, and HL-60) but not Jurkat cells.  Growth inhibition was shown to be due to inhibition of proliferation and, at a lesser extent, to increase in cell death.  Analysis of cytokine release showed that TAT-2 stimulated the release of TGF-β, yet TGF-β neutralization did not reverse the maesopsin-dependent effect. 

The drugs currently used for the therapy of AML are anthracycline and cytarabine.  In order to compare these drugs with TAT-2, we stimulated OCI-AML cells with sub-optimal concentrations of aracytidine (ARA-C), doxorubicine and TAT-2 alone or in combination.  TAT-2 given together with either ARA-c or Doxorubicin significantly decreased the OCI-AML cell number to the same level of ARA-C plus doxorubicin given together.  Thus, TAT-2 can significantly increase the effectiveness of the drugs used currently in the AML therapy.    

Gene expression profiling determined that Maesopsin modulated 19 identifiable genes.  Transcription factor CP2 was the gene most significantly modulated.  Real-time PCR validated that up-regulation of sulphiredoxin 1 homolog (SRXN1), hemeoxygenase 1 (HMOX1), and breast carcinoma amplified sequence 3 (BCAS3) were consistently modulated.  The role of HMOX1 has been analyzed in depth.  It is an anti-oxidant protein that, generally, protects cells from cell death.  A western blot analysis confirmed that HMOX1 mRNA was translated in its protein and both TAT-2 and the At leave decoction up-regulated its expression when compared to the untreated control.  Moreover, ARA-C and doxorubicin, the drugs currently used in the therapy of AML, did not up-regulate the HMOX1 protein.  Thus, also the western blot analysis indicate that TAT-2 but not aracytidine (ARA-C) or doxorubicin up-regulates HMOX1, confirming the data of microarray and RT-PCR for this particular gene.  To see if HMOX1 was responsible for the TAT-2-dependent growth inhibition, OCI-AML cells were transfected with HMOX1 transgene.  Results suggest that overexpression of HMOX1 did not decrease but rather significantly increased OCI-AML cell number, suggesting that HMOX1 overexpression was not responsible for TAT-2 dependent inhibition of OCI-AML cell growth.   

Decoction of the leaves of At has also been tested for its activity in a model of collagen-induced arthritis in mice.  In the thymus of these mice, a subclinical form of arthritis determined a block of differentiation of the step that bring to CD4+CD8+ double positive (DP) from CD4-CD8- double negative (DN) thymocytes.  The consequence was a dramatic increase in CD4-CD8- DN and a parallel decrease of DP thymocytes.  The administration of At decoction completely abrogated the differentiation block.         

10 anni dei corsi di laurea a Foligno

Posted in Farmaci e infermieri with tags , , , on December 13, 2013 by Domenico Delfino

10 anni 1

10anni 2

Il cavaliere che aveva un peso sul cuore

Posted in libri with tags , , , , , on November 27, 2013 by Domenico Delfino

“…”E’ vero! E guarda dove sono finito.”

“Non ricominciare con quella stupida solfa dei risultati.  Alla fine farai come dico io.  L’hai sempre fatto.  E’ così che deve essere.”

“E tu come lo sai? Dov’è la prova?”

“Non devo provarti un bel niente!” urlò il drago.  “Sei tu quello fissato con le prove.  Qui sono io che comando e tu mi devi obbedire.”

“Ah sì? E perché? Dove sta scritto?” Chiese ancora Duke, ma non attese la risposta.  “Non è scritto da nessuna parte, e lo sai.  E’ solo la tua opinione.  Ed è proprio grazie a molte delle tue opinioni se sono finito nei guai.  Prendiamo Jonathan, per esempio: secondo te doveva essere per forza un cacciatore di draghi.  Ma ormai è una storia vecchia.  Ho già vinto io, dimostrando che non è costretto a diventarlo e che non c’è nulla di terribile se sceglie una strada diversa.  Io posso benissimo andare avanti lo stesso.”

“Ah sì?” sogghignò il drago.  “Okay, signor so-tutto-io: immaginati di tornare all’Emporio degli Eroi, di sederti al bancone del bar con i tuoi amici, tutti eroi molto famosi, e sentirli raccontare le grandi imprese dei loro eroici figli.  Ti ci vedi a spiegare a tutti perché tuo figlio non fa niente di più virile che spostare un pezzo sulla scacchiera?  O a tentare di giustificarlo per il fatto che non gli importa un fico delle tradizioni della vostra famiglia, dal momento che non intende seguire le vostre orme?  Puoi raccontarti tutte le balle che vuoi, dicendoti che non c’è nessun problema: ma io lo so benissimo che il problema c’è, eccome.  Quando ti ci troverai vedrai che mi darai ragione.”…”.

(Tratto da Marcia Grad Powers, autrice di La principessa che credeva nelle favole “Il Cavaliere Che Aveva Un Peso Sul Cuore – Una storia indimenticabile per ritrovare la felicità e la serenità”, Edizioni PIEMME, 2003)

Il drago e la farfalla

Posted in libri with tags , , , , on October 21, 2013 by Domenico Delfino
Ricordando il Nord Ovest, 1955, Lacca

Ricordando il Nord Ovest, 1955, Lacca

(Tratto da “Il Drago e la Farfalla – Arte Contemporanea in Vietnam”, Gangemi Editore, 16 giugno- 16 luglio 2006)

Infezione virale e l’evoluzione delle vie di morte apoptotica e necrotica regolate da caspasi-8

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on October 14, 2013 by Domenico Delfino

RiassuntoI patogeni hanno come bersagli specifici sia la via di morte cellulare apoptotica dipendente da caspasi-8 che quella necrotica dipendente da receptor-interacting protein 1 (RIP1; conosciuto anche come RIPK1) e RIP3 (noto anche come RIPK3).  La fondamentale co-regolazione di queste due vie di morte cellulare è emersa quando la morte a metà gestazione di topi deficienti in Fas-associated death domain protein (FADD) o di caspasi-8 era contrastata dall’eliminazione di RIP1 o di RIP3, il chè indicava un legame molto più stretto di quello che si pensava precedentemente.  Quindi, i mammiferi necessitano di caspasi-8 durante l’embriogenesi per sopprimere le chinasi RIP1 e RIP3 come parte del dialogo tra due processi di morte cellulare distinti che insieme effettuano ruoli di rinforzo nella difesa dell’ospite contro i patogeni intracellulari come gli herpes virus.

Le vie di morte cellulare apoptotica e necrotica determinano il destino delle cellule di mammifero.  L’apoptosi segue delle vie ben definite che sono incentrate sulla cascata proteolitica dipendente dalle caspasi che coordina la vescicolazione delle membrane cellulari, la condensazione nucleare e la frammentazione del DNA, mantenendo l’integrità della membrana.  Al contrario, la necrosi è indipendente dalle caspasi e determina la forma rotonda della cellula ed il rigonfiamento citoplasmatico, terminando con la perdita dell’integrità di membrana e con perdita di citoplasma.  La necrosi è stata associata per lungo tempo con un tipo di morte da incidente (passiva) in tessuti danneggiati o malati; tuttavia, la morte necrotica programmata in contesti specifici è orchestrata in maniera autonoma  attraverso il receptor-interacting 1 (RIP1, anche conosciuto come RIPK1) e/o RIP3 (anche noto come RIPK3).  La forma meglio caratterizzata di necrosi programmata, nota come necroptosi, necessita dell’assemblaggio di un complesso di segnale da RHIM (motivo RIP di interazione omotipica) di RIP1 e RIP3.

                Diversi segnali cellulari intrinseci ed estrinseci convergono sull’attivazione delle caspasi esecutrici che mediano l’apoptosi.  Particolarmente nel caso di patogeni intracellulari (come i virus), l’apoptosi contribuisce alla difesa dell’ospite eliminando le cellule infette.  Esiste un macchinario apoptotico intrinseco in organismi metazoi per eliminare le cellule in eccesso durante lo sviluppo embrionale e per sostenere l’omeostasi tessutale, così come per eliminare cellule stressate, danneggiate o infette.  Al contrario, le vie estrinseche di morte si sono evolute più recentemente e facilitano la difesa dell’ospite contro i patogeni.  L’apoptosi intrinseca dipende dalla permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna da parte dei membri pro-apoptotici della famiglia B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) BAX e BAK.  In seguito alla permeabilizzazione mitocondriale, i fattori pro-apoptotici – come il citocromo c ed il Second Mitochondrial Activator of Caspases (SMAC; noto anche come DIABLO) – sono rilasciati nel citoplasma, ed innescano l’attivazione di caspasi 9 e delle caspasi effettrici a valle, come caspasi 3 e caspasi 7.  Queste caspasi effettrici  smantellano la cellula attraverso la distruzione proteolitica di substrati vitali.  Al contrario dell’apoptosi intrinseca, l’apoptosi estrinseca è iniziata da ligandi della famiglia del Tumour Necrosis Factor (TNF) che ingaggiano recettori di morte per attivare la caspasi 8.  L’attivazione di caspasi 8 in ultima analisi guida l’attivazione di caspasi 3 e/o caspasi 7 direttamente o indirettamente iniziando una via di amplificazione mitocondriale attraverso il membro pro-apoptotico BID della famiglia BCL-2.

                La necrosi programmata (necroptosi) dipendente da RIP1 e da RIP3 si disvela quando viene compromessa l’attività di caspasi 8.  Gli investigatori si sono impegnati per un decennio a spiegare perché i topi con una distruzione nella linea germinale del gene di caspasi 8, del gene della proteina FAS-Associated Death Domain (FADD) o del gene di FLICE-Like Inhibitory Protein cellulare (cFLIP; nota anche come CFLAR) muoiono durante la gestazione ai giorni 10 o 11 (vedi box 1).  Questo quadro di morte ha suggerito un’attività non apoptotica cruciale dei complessi caspasi 8-FADD-cFLIP.  Il salvataggio dalla letalità embrionale, come si osserva sia nei topi Casp8-/- RIP3-/- o in quelli Fadd-/-Rip1-/-, ha chiarito il ruolo di caspasi 8 nello sviluppo, implicando fortemente questo enzima nella soppressione fisiologica della necroptosi.  Questa interpretazione è stata facilitata dall’evidenza che il segnale dipendente dal recettore di morte regola la scelta tra apoptosi diretta da caspasi 8 e la promozione della necrosi programmata da parte degli inibitori delle caspasi.  Inoltre, si stanno accumulando evidenze che mostrano che la necrosi programmata dipendente da RIP1 e/o RIP3 può essere iniziata indipendentemente dai recettori di morte della superfamiglia del recettore TNF (TNFR) durante un’infezione virale o in seguito all’attivazione dei Toll-Like Receptors (TLR), così come avviene nella scena di stress genotossici.

Box 1 Lezioni da topi deficienti di FADD o caspasi-8

Gli spiccati fenotipi che emergono quando caspasi 8 o FAS-associated death domain protein (FADD) sono eliminati in tessuti murini specifici devono adesso essere visti alla luce delle conoscenze che un complesso caspasi 8-FADD controlla la necroptosi mediata da receptor-interacting protein 1 (RIP1) e RIP3.  Il controllo dell’apoptosi mediato da caspasi 8 è importante per l’omeostasi delle cellule T, come è stato rivelato da topi adulti Casp8-/-Rip3-/-, ed anche da topi con una distruzione di Casp8 o Fadd in un background Rip3-/ - specificamente nelle cellule T.  Inoltre, la distruzione tessuto-specifica di Casp8 o Fadd ha rivelato molti esempi di condizioni in cui la necroptosi può essere svelata durante la vita.  La deficienza di caspasi 8 in cellule endoteliali TIE 1+ risulta in un fenotipo che è parallelo alla distruzione nella linea germinale, rinforzando la conclusione che la disregolazione di RIP1-RIP3 è alla base dei difetti delle cellule vascolari e della morte embrionale in topi Casp8 null.  L’alterazione inducibile con interferone di Casp8 o Fadd porta all’eliminazione di cellule in varie linee, e ciò sopprime lo sviluppo ematopoietico precoce e di medio tempo.  L’alterazione di Casp8 o Fadd in cellule B CD19+ non altera la loro risposta all’antigene, anche se le cellule mutanti non proliferano e muoiono in risposta ad agonisti dei Toll-like receptor 3 (TLR3) e TLR4 che inducono un segnale attraverso TIR domain-containing adaptor protein inducing IFNβ (TRIF).  Ciò fornisce un potenziale legame biologico al ripoptosoma di recente identificazione.  L’alterazione di Casp8 nell’epidermide risulta in dermatite atopica durante il processo di corneificazione ed è stato usato come modello di malattia cronica della cute.  Inoltre, topi che esprimono una forma cataliticamente inattiva di caspasi 8 insieme ad un solo allele normale sviluppano infiammazione in organi interni e cute.  La deficienza di caspasi 8 specifica degli epatociti risulta in una forte risposta infiammatoria in seguito ad epatectomia parziale ed rigenerazione epatica alterata, probabilmente attraverso l’induzione della necroptosi.  Nonostante debba essere ancora riportata un’analisi completa, i topi Casp8-/-Rip3-/- continuano la loro vita senza soffrire di nessun ovvio deficit a parte l’anormale livello delle cellule T.  E’ rimarchevole che, nonostante un quadro di morte gestazionale a medio termine in topi Casp8-/- , le mutazioni combinate di Casp8 e Rip3  risultano in un embrione con cuore funzionante, un’architettura correttamente organizzata dell’endotelio del sacco vitellino e livelli normali di ematopoiesi.  Questi topi sembrano normali e completano la gestazione per divenire adulti fertili senza infiammazione anormale, similmente ai topi Rip3-/-.  Embrioni Fadd-/-Rip1-/- appaiono normali lungo tutta la gestazione ma muoiono appena dopo la nascita a causa dell’assenza di RIP1.  La vitalità dei topi Casp8-/-Rip3-/-stabilisce largamente che caspasi 8 non è indispensabile per lo sviluppo e l’omeostasi tissutale dei mammiferi.  Quindi, i molti scenari in cui la caspasi 8 sembrava cruciale richiedono un riesame.  La recente dimostrazione che la deficienza di RIP3 salva dalla necroptosi epiteliale rinforza questo fatto.  Quindi, è probabile che anormalità infiammatorie severe che insorgono quando caspasi 8 (o FADD) sono compromessi siano la conseguenza dell’attivazione della necroptosi.    

                La scelta tra vie necrotica ed apoptotica in seguito a legame dei recettori di morte è stata studiata estensivamente.  Allo stesso modo, rapporti recenti indicano una intima associazione tra infiammazione e disregolazione della necrosi programmata, ma l’obiettivo di questa rassegna sono le vie molecolari coinvolte nella regolazione della necrosi programmata, discute il potenziale contributo delle infezioni virali all’evoluzione della necrosi programmata nel modo che attualmente si conosce nei mammiferi, e riassume le ultime evidenze del contributo delle vie di morte cellulare all’omeostasi immune.

I partecipanti nel segnale del recettore di morte

I recettori di morte, inclusi TNFR1 e FAS (anche noto come CD95), controllano tre risposte cellulari nei topi e nell’uomo: prima, una risposta citochinica pro-infiammatoria che dipende dal Nuclear Factor-kB (NF-kB); seconda, l’apoptosi; e terza, la necroptosi.  L’attivazione del fattore di trascrizione NF-kB contribuisce all’infiammazione ed alla soppressione della morte cellulare, e le relazioni tra processi pro-infiammatori e di morte cellulare che sono sotto il controllo dei recettori di morte  probabilmente contribuiscono alla patologia della malattia in molti contesti.  Altri membri della superfamiglia del TNFR guidano l’attivazione di NF-kB e dell’infiammazione senza indurre morte cellulare.  Questi, insieme a molte classi di Pattern Recognition Receptors (PRR), scolpiscono la risposta infiammatoria.  Queste risposte infiammatorie contribuiscono al riconoscimento ed alla eliminazione delle infezioni microbiche attraverso l’attività di citochine che iniziano l’eliminazione delle cellule infette attraverso la morte cellulare programmata.  Le funzioni che si sovrappongono rimangono uno dei temi principali quando si prende in considerazione il riconoscimento dei patogeni ed il segnale dei recettori di morte nella difesa dell’ospite.

Attivazione di caspasi 8Il legame dei recettori di morte della superfamiglia del TNFR promuove l’assemblaggio del complesso che contiene caspasi 8 e FADD e che inizia l’apoptosi.  Il segnale attraverso FAS, TRAIL Receptor 1 (TRAILR1) o TRAILR2 risulta nell’interazione tra i domini di morte del recettore e FADD, e ciò porta alla formazione del complesso di segnale associato al recettore che induce morte (DISC).  Il DISC recluta caspasi 8 attraverso l’interazione del Dominio Effettore di Morte (DED) con FADD.  Ne consegue apoptosi in seguito alla omodimerizzazione di caspasi 8 ed al suo auto-clivaggio, che libera la piena attività dell’enzima.  Le due isoforme di cFLIP – cFLIP lungo (cFLIPL) e cFLIP corto (cFLIPS) – sono paraloghi non catalitici di caspasi 8 che eterodimerizzano con caspasi 8 per sopprimere l’auto-processazione che è necessaria per l’induzione dell’apoptosi (Fig. 1).

Figura 1.  Regolazione delle vie di segnale di RIP1-RIP3 mediata da caspasi 8.  a.  In seguito al legame del tumor necrosis factor (TNF), il recettore 1 del TNF (TNFR1) recluta receptor-interacting protein 1 (RIP1) attraverso il proprio dominio di morte.  Quando viene poliubiquitinato dalla ligasi E3 cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis 1), cIAP2 e LUBAC (complesso di assemblaggio della catena lineare di ubiquitina), RIP1 promuove l'attivazione di NF-kB (Nuclear factor kB), che aumenta la sopravvivenza cellulare inducendo l'espressione di cIAP1, cIAP2 e cFLIP (cellular FLICE-like inhibitory protein)(non mostrato).  In mancanza di poliubiquitinazione di RIP1 (per esempio a causa ad insufficienti livelli di cIAP o di deubiquitinazione da parte di proteine come cilindromatosi (CYLD)), l’attività chinasica di RIP1 a valle del TNFR1 facilita l’assemblaggio di piattaforme alternative di segnale che comprendono RIP1, FADD (FAS-associated death domain protein) e caspasi 8.  In uno scenario alternativo, TRIF (Toll-like receptor 3 –TLR3- and TLR4 adaptor protein TIR domain-containing adaptor protein inducing IFNβ) si lega sia a RIP1 che a RIP3 attraverso interazioni mediate da RHIM (RIP homotypic interaction motif), collegando il segnale di TLR3 al complesso RIP1-FADD-caspasi 8 (ripoptosoma).  Il danno genotossico e lo stress cellulare porta alla degradazione di cIAP1 e cIAP2 ed alla formazione del ripoptosoma.  Il sensore citosolico di DNA DAI (DNA-dependent activator of interferon regulatory factors) lega direttamente RIP1 e RIP3 in complessi dipendenti da RHIM potenzialmente per guidare l’assemblaggio ed/o il reclutamento di un ripoptosoma, in maniera simile a TRIF.  I livelli di cFLIP, l’equilibrio tra le isoforme di cFLIP ed i livelli di attività di caspasi 8 determinano se in seguito alla formazione del ripoptosoma consegue apoptosi, necroptosi o sopravvivenza cellulare.  b.  Quando i livelli di cFLIP lungo (cFLIPL) o corto (cFLIPS) sono limitanti, l’omodimerizzazione di caspasi 8 ne promuove l’attività enzimatica, e questo porta all’autoprocessazione di caspasi 8 ed all’esecuzione dell’apoptosi attraverso BID e/o caspasi 3.  c, d.  In presenza di quantità sufficienti di cFLIPL e cFLIPS, si forma un eterodimero caspasi 8-cFLIPL o caspasi 8-cFLIPs, e ciò supporta la sopravvivenza.  E’ importante il fatto che l’eterodimero caspasi 8-cFLIPL ritenga una sufficiente attività proteolitica per clivare substrati quali RIP1 e CYLD e per inibire la necroptosi senza consentire a caspasi 8 di indurre apoptosi.  e.  La sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T in seguito a stimolazione del TCR (T-cell receptor) e di CD28 richiede l’inattivazione della necroptosi mediata da RIP1 e RIP3 attraverso FADD-caspasi 8-cFLIPL, e questo avviene probabilmente a valle del complesso di segnale CARMA1-BCL-10-MALT1.  f.  Quando è bloccata l’attività di caspasi 8 – in condizioni di elevati livelli di cFLIPS  o in presenza di inibitori di caspasi 8 – RIP1 si lega a RIP3 per formare un necrosoma chinasico attivo per iniziare la necroptosi.  L’attività chinasica RIP1 guida l’assemblaggio della piattaforma citosolica di segnale RIP1-FADD-caspasi 8, così come del necrosoma.  L’inibitore della chinasi RIP1 necrostatina 1 (Nec1) blocca sia l’apoptosi che la necroptosi dipendente da RIP1.  Le stelle indicano la caspasi 8 cataliticamente attiva:  DED, death effector domain; dsDNA, double stranded DNA; dsRNA, double stranded RNA; PKCϴ, protein kinase Cϴ; TRADD, TNFR1-associated death domain protein; TRAF2, TNFR-associated factor 2; Ub, ubiquitin.

Figura 1. Regolazione delle vie di segnale di RIP1-RIP3 mediata da caspasi 8. a. In seguito al legame del tumor necrosis factor (TNF), il recettore 1 del TNF (TNFR1) recluta receptor-interacting protein 1 (RIP1) attraverso il proprio dominio di morte. Quando viene poliubiquitinato dalla ligasi E3 cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis 1), cIAP2 e LUBAC (complesso di assemblaggio della catena lineare di ubiquitina), RIP1 promuove l’attivazione di NF-kB (Nuclear factor kB), che aumenta la sopravvivenza cellulare inducendo l’espressione di cIAP1, cIAP2 e cFLIP (cellular FLICE-like inhibitory protein)(non mostrato). In mancanza di poliubiquitinazione di RIP1 (per esempio a causa ad insufficienti livelli di cIAP o di deubiquitinazione da parte di proteine come cilindromatosi (CYLD)), l’attività chinasica di RIP1 a valle del TNFR1 facilita l’assemblaggio di piattaforme alternative di segnale che comprendono RIP1, FADD (FAS-associated death domain protein) e caspasi 8. In uno scenario alternativo, TRIF (Toll-like receptor 3 –TLR3- and TLR4 adaptor protein TIR domain-containing adaptor protein inducing IFNβ) si lega sia a RIP1 che a RIP3 attraverso interazioni mediate da RHIM (RIP homotypic interaction motif), collegando il segnale di TLR3 al complesso RIP1-FADD-caspasi 8 (ripoptosoma). Il danno genotossico e lo stress cellulare porta alla degradazione di cIAP1 e cIAP2 ed alla formazione del ripoptosoma. Il sensore citosolico di DNA DAI (DNA-dependent activator of interferon regulatory factors) lega direttamente RIP1 e RIP3 in complessi dipendenti da RHIM potenzialmente per guidare l’assemblaggio ed/o il reclutamento di un ripoptosoma, in maniera simile a TRIF. I livelli di cFLIP, l’equilibrio tra le isoforme di cFLIP ed i livelli di attività di caspasi 8 determinano se in seguito alla formazione del ripoptosoma consegue apoptosi, necroptosi o sopravvivenza cellulare. b. Quando i livelli di cFLIP lungo (cFLIPL) o corto (cFLIPS) sono limitanti, l’omodimerizzazione di caspasi 8 ne promuove l’attività enzimatica, e questo porta all’autoprocessazione di caspasi 8 ed all’esecuzione dell’apoptosi attraverso BID e/o caspasi 3. c, d. In presenza di quantità sufficienti di cFLIPL e cFLIPS, si forma un eterodimero caspasi 8-cFLIPL o caspasi 8-cFLIPs, e ciò supporta la sopravvivenza. E’ importante il fatto che l’eterodimero caspasi 8-cFLIPL ritenga una sufficiente attività proteolitica per clivare substrati quali RIP1 e CYLD e per inibire la necroptosi senza consentire a caspasi 8 di indurre apoptosi. e. La sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T in seguito a stimolazione del TCR (T-cell receptor) e di CD28 richiede l’inattivazione della necroptosi mediata da RIP1 e RIP3 attraverso FADD-caspasi 8-cFLIPL, e questo avviene probabilmente a valle del complesso di segnale CARMA1-BCL-10-MALT1. f. Quando è bloccata l’attività di caspasi 8 – in condizioni di elevati livelli di cFLIPS o in presenza di inibitori di caspasi 8 – RIP1 si lega a RIP3 per formare un necrosoma chinasico attivo per iniziare la necroptosi. L’attività chinasica RIP1 guida l’assemblaggio della piattaforma citosolica di segnale RIP1-FADD-caspasi 8, così come del necrosoma. L’inibitore della chinasi RIP1 necrostatina 1 (Nec1) blocca sia l’apoptosi che la necroptosi dipendente da RIP1. Le stelle indicano la caspasi 8 cataliticamente attiva: DED, death effector domain; dsDNA, double stranded DNA; dsRNA, double stranded RNA; PKCϴ, protein kinase Cϴ; TRADD, TNFR1-associated death domain protein; TRAF2, TNFR-associated factor 2; Ub, ubiquitin.

Il segnale di TNFR1 coinvolge il reclutamento della proteina TNFR1-Associated Death Domain (TRADD), insieme a RIP1, nel complesso I.  Questo guida l’attivazione di NF-kB e di MAPK, che inducono geni di sopravvivenza, inclusi quelli che codificano per cFLIP e cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP1 e cIAP2; chiamati qui collettivamente cIAP).  All’interno del complesso di segnale del TNFR1, cIAP ed il complesso di assemblaggio della catena di ubiquitina (LUBAC) poliubiquitina RIP1 per promuovere il legame di Ikβ kinase-β (IKKβ) da parte del modulatore essenziale di NF-kB (NEMO; anche conosciuto come IKKγ), che risulta nella trascrizione genica mediata da NF-kB.  RIP1 poliubiquitinato non supporta l’apoptosi o la necrosi programmata.  Quando cIAP è inibito – naturalmente da SMAC o sperimentalmente attraverso l’applicazione di mimetici di SMAC – o quando il componente di LUBAC SHARPIN è assente, si attivano le vie estrinseche di morte che contribuiscono all’apoptosi ed alla necrosi programmata.  La deubiquitinazione di RIP1 da parte di enzimi del tipo della cilindromatosi (CYLD) diminuisce l’attivazione di NF-kB e rende capace l’attività chinasica di RIP1 di dirigere la formazione della piattaforma citosolica simile al DISC che attiva caspasi 8 conosciuta come complesso II, che è composto da caspasi 8, FADD e cFLIP (Fig. 1).

Quando caspasi 8 è compromessa, la necrosi programmata è iniziata dal complesso RIP1-RIP3 che è stato chiamato necrosoma.  E’ importante che caspasi 8 cataliticamente attiva, ma non clivabile, mantenga la capacità di sopprimere la necrosi programmata e possa prevenire la letalità embrionale causata dalla mancanza di caspasi 8.  La caspasi 8 orchestra l’apoptosi e previene la necroptosi insieme al suo attivatore FADD (Fig 1b).  Entrambe le isoforme di cFLIP inibiscono l’apoptosi indotta da caspasi 8 (Fig. 1c, d); tuttavia, in presenza di livelli sufficienti di RIP3, cFLIPS promuove la necroptosi dipendente da RIP1 e da RIP3 (Fig. 1f), mentre cFLIPL blocca la necroptosi.  Al contrario dell’eterodimero caspasi 8-cFLIPS, caspasi 8-cFLIPL mantiene una sufficiente attività proteolitica per inattivare gli adattatori chiave, RIP1 e RIP3, così come l’enzima deubiquitinante CYLD.  Ciò previene l’oligomerizzazione dipendente da RHIM di RIP1 e RIP3 all’interno del necrosoma (Fig. 1e).

Il ripoptosoma.  Investigazioni recenti hanno esaminato il ruolo di caspasi 8 e FADD nella regolazione della necroptosi in seguito a stimolazione attraverso PRR (come TLR3) o attraverso l’induzione di stress genotossico.  Questi hanno mostrato che i segnali dipendenti da TLR3 o indotti dal danno al DNA promuovono la formazione di un complesso ad alto peso molecolare chiamato ripoptosoma, che contiene RIP1, FADD, caspasi 8 e cFLIP.  Questo complesso regola il destino cellulare funzionando come piattaforma di attivazione di caspasi 8 e ricorda il complesso II indotto da TNFR1, anche se è assemblato indipendentemente dal segnale del recettore di morte.  Nel segnale del TLR3, TRIF (TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon-β) recluta il ripoptosoma attraverso l’interazione dipendente da RHIM con RIP1.  Qui, come nelle vie dei recettori di morte, l’attività proteolitica di caspasi 8-cFLIPL sopprime la necroptosi.  La necroptosi mediata da TRIF in risposta alla stimolazione di TLR3 o TLR4 può sottolineare la patogenesi dell’infiammazione batterica acuta nelle condizioni in cui l’attività di caspasi 8 è compromessa.  Allo stesso modo, lo stress genotossico può indurre la degradazione di cIAP, guidando la formazione del ripoptosoma.  Evidenze crescenti suggeriscono che anche la stimolazione del TCR risulta nella formazione di un complesso simile al ripoptosoma.  Quindi, sembra che una varietà di stimoli intracellulari ed extracellulari regolino la formazione del ripoptosoma, espandendo il numero delle scene in cui le scelte di morte cellulare sono controllate dall’attività di caspasi 8.  E’ prevedibile che le scene in cui l’eterodimero caspasi 8-cFLIPS domina durante l’infezione o l’infiammazione favoriscano la necroptosi (Fig. 1f).

Il ruolo della caspasi 8 nel segnale del TCR

Cellule T deficienti di caspasi 8 o di FADD muoiono quando vengono stimolate dall’antigene.  Il salvataggio della funzione delle cellule T attraverso la delezione di Rip1 o Rip3 – come si può osservare in topi Casp8-/-Rip3-/-, in topi con cellule ematopoietiche Fadd-/-Rip1-/-, ed in topi con deficienza specifica nelle cellule T di caspasi 8 o di FADD su un background Rip3-/- – indica che alla base di questa perdita di cellule T c’è la necroptosi.  Evidenze precoci che hanno legato l’attivazione di NF-kB, così come l’autofagia, con questo tipo di morte delle cellule T non è supportata da dati attuali.  E’ diventato molto chiaro che l’attivazione del TCR in cellule T deficienti di caspasi 8 o di FADD promuove la necroptosi dipendente da RIP1 e da RIP3.  Il complesso CARMA1-BCL-10-MALT1 (Fig. 1a) attiva l’NF-kb in seguito al riconoscimento dell’antigene attraverso il TCR, mentre dirige anche la formazione di un complesso che contiene caspasi 8, cFLIPL e RIP1.  Nonostante il fatto che FADD e caspasi 8 siano essenziali per la proliferazione delle cellule T in risposta agli antigeni, l’attivazione delle cellule T non risulta in apoptosi.  Invece, una spiegazione basata su supporti sperimentali del 2008, che la necroptosi segue al legame dell’antigene in cellule T deficienti di caspasi 8 o di FADD, continua ad implicare un’inattivazione mediata da RIP1 e/o RIP3 da parte di un complesso caspasi 8-cFLIPL in seguito a stimolazione del TCR.  Rimane da spiegare completamente se la stimolazione del TCR induce vie necroptotiche in cellule T non transgeniche o in scenari più fisiologici.

Necrosi programmata mediata da RIP1 e RIP3

Necrosi programmata (necroptosi) dipendente da RIP1 e RIP3.  La necroptosi si osserva quando l’attività di caspasi 8 è compromessa.  In Drosophila melanogaster ed in zebrafish, gli omologhi di caspasi 8 e FADD non hanno nessun ruolo nello sviluppo.  Al contrario, la letalità embrionale nei topi che hanno una mutazione nella linea germinale in Casp8 o in FADD indica che un passaggio chiave nello sviluppo dei mammiferi richiede l’attività di caspasi 8.  Le cellule endoteliali ed ematopoietiche sono le più influenzate in assenza di caspasi 8, suggerendo che un normale sviluppo si basa sulla sopravvivenza di queste cellule.  Un complesso di FADD, caspasi 8 e cFLIPL restringe l’attivazione aberrante di RIP1-RIP3 durante lo sviluppo dei mammiferi, anche se i segnali precisi, estrinseci o intrinseci, che innescano l’attivazione di caspasi 8 e RIP1-RIP3 in questi tipi cellulari deve ancora essere definita (Box 1).  Nonostante sia possibile il coinvolgimento del segnale dei recettori di morte, riconoscere che la formazione del ripoptosoma segue segnali cellulari intrinseci ed estrinseci suggerisce nuovi possibili meccanismi per l’attivazione di caspasi 8 e l’eliminazione del segnale di RIP1-RIP3 (Fig. 1).  I partecipanti decisivi che promuovono la letalità embrionale sono chiari; tuttavia, gli eventi a valle nell’esecuzione della necroptosi e della perdita fetale rimangono vaghi.  Sono emersi molti possibili bersagli dell’attività chinasica RIP1-RIP3 da varie analisi, ma ancora è necessario incastrarli nelle vie di morte cellulare.

Oltre al contributo alla difesa dell’ospite durante le infezioni virali (vedi sotto), la necroptosi è coinvolta nell’infiammazione cronica dell’intestino guidata dai batteri (come è stato mostrato in topi  che non hanno FADD o caspasi 8 nelle cellule epiteliali intestinali) e nell’infiammazione spontanea che avviene nella cute di topi che hanno una deficienza specifica di FADD.  Queste scoperte suggeriscono che la necroptosi possa essere alla base delle malattie infiammatorie che influenzano l’intestino e la cute nell’uomo.

Necrosi programmata indipendente da RIP1, dipendente da RIP3. RIP3 è necessaria per la necroptosi, così come per la necrosi programmata indotta dal citomegalovirus (MCMV) murino, ma non contribuisce direttamente all’apoptosi o all’attivazione di NF-kB indotte da TNFR o TLR.  Nonostante la loro incapacità a supportare la necroptosi o la necrosi programmata indotta da MCMV, i topi Rip3-/-non hanno anormalità di sviluppo o immunologiche evidenti.  Questi animali mostrano un livello completo di resistenza ai patogeni murini naturali, incluso l’MCMV, il virus dell’epatite murina ed il virus della coriomeningite linfocitaria.  Tuttavia, i topi deficienti di RIP3 sono fortemente suscettibili all’infezione da vaccinia virus, un membro della famiglia dei poxvirus.  Quindi, le vie dipendenti da RIP3 probabilmente contribuiscono alla difesa dell’ospite contro le infezioni virali.  Tuttavia, queste vie dipendenti da RIP3 si sono forse evolute pagando un costo, dal momento che livelli anormali di necrosi possono associarsi a malattie infiammatorie sterili, così come da quelle indotte da patogeni.

                Nonostante la necrosi programmata indotta da MCMV richieda attività chinasica RIP3 ed interazioni dipendenti da RHIM, è indipendente da RIP1 e quindi è distinta dalla necroptosi.  La morte necrotica indotta da MCMV elimina rapidamente le cellule infette, rimuovendo quindi l’infezione prima che possa avvenire la replicazione virale; queste scoperte rinforzano l’idea che questa via abbia un ruolo importante nella difesa dell’ospite.  Dato che RIP1 e TRIF non sono coinvolti in questa via, è possibile che RIP3 o formi un complesso omotipico o interagisca con un’altra proteina cellulare che contiene RHIM.  DNA-dependent activator of interferon regulatory factors (DAI; anche noto come ZBP1) rimane un attraente candidato partner per RIP3 (Fig. 1a).  DAI e RIP3 formano un complesso dipendente da RHIM, e l’inibitore virale dell’attivazione di RIP codificato da MCMV (vIRA) blocca questa interazione.  DAI è un sensore citosolico di DNA che potenzialmente contribuisce alla difesa dell’ospite contro il citomegalovirus umano.  Nonostante che topi deficienti di DAI non manifestino un fenotipo ovvio nello sviluppo e mantengano la capacità di riconoscere il DNA citosolico, questi topi ci aiuteranno a chiarire il ruolo di questo adattatore nella necrosi programmata indotta da MCMV.

Controllo virale della necrosi programmata

I Virus fanno affidamento pesantemente sul destino delle cellule infette e si sono evoluti per codificare soppressori della morte cellulare che aumentano la diffusione virale prevenendo l’eliminazione delle cellule.  L’esistenza di questi soppressori forniscono delle evidenze tangibili che entrambe le vie apoptotica e necrotica siano un beneficio per la difesa dell’ospite.  E’ possibile apprezzare il compendio di vie biologiche cruciali incontrate da ciascun patogeno virale attraverso i soppressori che i patogeni codificano.  La necrosi programmata può avvenire quando è compromessa la caspasi-8, il chè suggerisce che l’abbondanza di inibitori virali della caspasi-8 (Tabella I) può aver guidato l’evoluzione della necrosi programmata come un controadattamento della difesa dell’ospite.  Sono stati identificati pochi inibitori della necrosi programmata (Fig. 2; Tabella 1), che ad un primo sguardo potrebbero suggerire una potenziale recente emersione.  Tuttavia, dal momento che la necrosi programmata ha soltanto recentemente ottenuto i gradi di via per la difesa dell’ospite, potrebbero essere presto riconosciuti altri meccanismi ed inibitori della necrosi programmata.

                L’attivazione della caspasi-8 è prevenuta da varie molecole codificate da patogeni, inclusa la proteina p35 del baculovirus, la proteina adenovirale E3 di 14.7 kDa, molte serpine e vFLIP (FLIP virale) dei poxvirus e la proteina vICA (inibitore virale dell’attivazione della caspasi-8) del citomegalovirus (Fig. 2).  Le cellule infettate dal Vaccinia virus diventano suscettibili alla necroptosi indotta dai recettori di morte a causa dell’inibizione della caspasi-8 da parte di un inibitore virale nelle cellule dell’ospite che hanno un livello sufficiente di RIP3.  Queste caratteristiche aiutano a spiegare la suscettibilità di topi deficienti di RIP3 ad un’infezione letale da vaccinia virus, così come a spiegare il perché la necroptosi può essere vista come una trappola per eliminare le cellule quando è compromessa l’attività della caspasi-8.

I citomegalovirus sono herpes virus antichi da un punto di vista dell’evoluzione che danno luogo ad una patogenesi complessa e possono persistere in cellule bersaglio epiteliali, mieloidi ed endoteliali.  Come altri virus dei mammiferi, gli herpes virus differiscono in patogenicità e virulenza in gran parte a causa della loro espressione di modulatori immuni che facilitano l’infezione minando l’immunità dell’ospite sia innata che adattiva.  La presenza in tutti i citomegalovirus dei mammiferi di inibitori dell’attività della caspasi-8 e di inibitori mitocondriali dell’apoptosi ben conservati che hanno come bersagli l’attivazione di BAX e BAK dimostrano che le vie della morte cellulare apoptotica contribuiscono all’eliminazione virale.

Avendo come bersaglio la caspasi-8, il vICA derivato dal citomegalovirus riduce l’impatto del controllo associato ai recettori di morte dell’ospite sul virus.  Inoltre, l’MCMV contrasta la morte necrotica codificando vIRA, che è un prodotto del gene M45 che blocca le vie di segnale dipendenti da RHIM, incluse la necroptosi e l’apoptosi indotte dai recettori di morte, l’apoptosi dipendente da TRIF e l’attivazione di NF-kB dipendente da TRIF o da DAI.  La regione di M45 che codifica il dominio RHIM, che è cruciale per la funzione di vIRA, non è presente nei citomegalovirus dei primati,  anche se il gene è conservato in altro modo.  Il citomegalovirus del ratto codifica per uno stretto omologo di vIRA e, in modo interessante, un ortologo evolutivamente distante può essere portato dal virus herpes simplex 2.

Una comprensione del ruolo di vIRA nella patogenesi virale è emersa da studi su una precisa mutazione che ha colpito solo il dominio RHIM.  MCMV originali si replicano in maniera equivalente sia in topi normali che Rip3-/-, dimostrando che le vie RIP3 fanno poca differenza durante l’infezione di un herpes virus completamente equipaggiato che quindi ha una batteria completa di modulatori immuni.  Al contrario, MCMV con una mutazione specifica di M45 è completamente attenuato dalle vie dipendenti da RIP3 in topi C57BL/6.  E’ importante il fatto che la replicazione e la patogenesi di un virus mutante sono completamente normalizzati in topi deficienti di RIP3, un fatto che stabilisce una relazione diretta tra RIP3 come bersaglio e vIRA come soppressore di morte cellulare che degrada RHIM.

L’adattamento evolutivo della morte necrotica in una via di difesa dell’ospite può aver guidato l’acquisizione di vIRA da un progenitore di MCMV (e di un citomegalovirus dei ratti), anche se apparentemente questa acquisizione non ha influenzato i citomegalovirus dei primati.  Una volta che un vertebrato primordiale si è evoluto per eseguire la necrosi programmata in risposta ad inibitori delle caspasi codificati da patogeni, la corsa agli armamenti è stata aumentata mentre il patogeno si evolveva per contrastare l’ulteriore via di morte.  Ciascuna coppia patogeno-ospite ha raggiunto una tregua, ma le soluzioni variano.  Il fatto che vICA dell’MCMV abbiano come bersaglio la caspasi-8 e che questo sensibilizzi le cellule alla necrosi indotta da MCMV, che può essere soppressa da vIRA, è in accordo con questo scenario evolutivo.  Cicli di adattamento e controadattamento patogeno-ospite sono avvenute durante l’evoluzione e, nel caso degli herpes virus, la sopravvivenza sia dei patogeni che dell’ospite coinvolge una battaglia che cambia continuamente durante la vita di un individuo, così come una guerra che viene condotta in tempi evolutivi all’interno di popolazioni.  Oltre a vIRA, anche molti vFLIP – cioè, MC159 del virus contagioso del mollusco, E8 del virus herpes 1 equino e K13 dell’herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (conosciuto anche come herpes virus 8 umano) – hanno la capacità di bloccare sia l’apoptosi che la necroptosi.  Questi vFLIP sono strutturalmente molto simili all’isoforma cFLIPS e allo stesso modo inibiscono l’attività enzimatica di caspasi-8; quindi, i meccanismi biochimici attraverso cui questi inibitori virali prevengono la necroptosi devono ancora essere stabiliti. 

Dato che sono state descritte solo due strategie antinecrotiche, l’assenza di un inibitore dipendente da RHIM simile a vIRA nel citomegalovirus dei primati può essere dovuto ad un adattamento indipendente, come per esempio un meccanismo che sopprime l’attività della chinasi RIP3, e questo vale la pena che venga esplorato ulteriormente.

tabella 1 kaiser

Figura 2.  Modulazione virale dei segnali di morte cellulare mediata dall’attivazione di caspasi 8 e dalle vie RIP1-RIP3. a.Le proteine virali che hanno come bersaglio diretto receptor-interacting protein 1 (RIP1), FAS-associated death domain protein (FADD) e/o caspasi 8 sopprimono le vie di segnale che sono attivate dai recettori di morte, dai pattern recognition receptors (PPR; come il Toll-like receptor 3 (TLR3)) o dallo stress cellulare (come il danno del DNA).  Molte proteine codificate da virus bloccano l’apoptosi dipendente da caspasi 8 interferendo con la caspasi 8, FADD, e/o RIP1 (vedi anche la tabella 1).  Molte proteine dei poxvirus della famiglia della serpina si legano direttamente a caspasi 8 completamente processata per prevenire l’apoptosi, mentre altri inibitori virali della caspasi 8 – come vICA (inibitore virale dell’attivazione di caspasi 8), CrmA e B13R (tutte evidenziate in blu)- sensibilizzano le cellule alla necroptosi indotta da recettori di morte attraverso l’alterazione della soppressione dell’attività RIP1-RIP3 mediata da caspasi 8.  Una sottopopolazione di viral FLICE-like inhibitory proteins (vFLIP) – incluse MC159, E8 e la proteina vIRA (viral inhibitor of RIP activation) del citomegalovirus (MCMV) murino- blocca sia l’apoptosi che la necroptosi mediata da da RIP1 e da RIP3.  b) La proteina vICA dell’MCMV previene l’attivazione di caspasi 8, e ciò sensibilizza le cellule alla necroptosi indotta dal recettore di morte.  Inoltre, la proteina vIRA dell’MCMV blocca la necroptosi e la necrosi programmata indotta da MCMV inibendo le interazioni dipendenti da RHIM (RIP homotypic interaction motif).  vIRA inibisce anche l’attivazione di caspasi 8 da parte di RIP1 o di TRIF (TIR domain-containing adaptor protein inducing IFNβ.  c) Un MCMV mutante che codifica vIRA con un dominio RHIM mutante innesca la necrosi programmata in cellule con livelli sufficienti di RIP3.  La necrosi programmata indotta da MCMV è indipendente da RIP1.  Il sensore di DNA citosolico contenente RHIM a doppia elica DAI (DNA-dependent activator of interferon regulatory factors) promuove forse la necrosi programmata dipendente da RIP3 durante l’infezione con MCMV mutante.  Le stelle indicano la caspasi 8 cataliticamente attiva.  BHV-4, herpes virus bovino 4; DED, death effector domain; EHV-1, herpes virus equini 1; HCMV, citomegalovirus umano; HPV-16, papilloma virus umano 16; HSV, virus herpes simplex; HVS herpes virus saimiri; KSHV, herpes virus associato al sarcoma di Kaposi; MCV, virus contagioso del mollusco.

Figura 2. Modulazione virale dei segnali di morte cellulare mediata dall’attivazione di caspasi 8 e dalle vie RIP1-RIP3.
a. Le proteine virali che hanno come bersaglio diretto receptor-interacting protein 1 (RIP1), FAS-associated death domain protein (FADD) e/o caspasi 8 sopprimono le vie di segnale che sono attivate dai recettori di morte, dai pattern recognition receptors (PPR; come il Toll-like receptor 3 (TLR3)) o dallo stress cellulare (come il danno del DNA). Molte proteine codificate da virus bloccano l’apoptosi dipendente da caspasi 8 interferendo con la caspasi 8, FADD, e/o RIP1 (vedi anche la tabella 1). Molte proteine dei poxvirus della famiglia della serpina si legano direttamente a caspasi 8 completamente processata per prevenire l’apoptosi, mentre altri inibitori virali della caspasi 8 – come vICA (inibitore virale dell’attivazione di caspasi 8), CrmA e B13R (tutte evidenziate in blu)- sensibilizzano le cellule alla necroptosi indotta da recettori di morte attraverso l’alterazione della soppressione dell’attività RIP1-RIP3 mediata da caspasi 8. Una sottopopolazione di viral FLICE-like inhibitory proteins (vFLIP) – incluse MC159, E8 e la proteina vIRA (viral inhibitor of RIP activation) del citomegalovirus (MCMV) murino- blocca sia l’apoptosi che la necroptosi mediata da da RIP1 e da RIP3. b) La proteina vICA dell’MCMV previene l’attivazione di caspasi 8, e ciò sensibilizza le cellule alla necroptosi indotta dal recettore di morte. Inoltre, la proteina vIRA dell’MCMV blocca la necroptosi e la necrosi programmata indotta da MCMV inibendo le interazioni dipendenti da RHIM (RIP homotypic interaction motif). vIRA inibisce anche l’attivazione di caspasi 8 da parte di RIP1 o di TRIF (TIR domain-containing adaptor protein inducing IFNβ. c) Un MCMV mutante che codifica vIRA con un dominio RHIM mutante innesca la necrosi programmata in cellule con livelli sufficienti di RIP3. La necrosi programmata indotta da MCMV è indipendente da RIP1. Il sensore di DNA citosolico contenente RHIM a doppia elica DAI (DNA-dependent activator of interferon regulatory factors) promuove forse la necrosi programmata dipendente da RIP3 durante l’infezione con MCMV mutante. Le stelle indicano la caspasi 8 cataliticamente attiva. BHV-4, herpes virus bovino 4; DED, death effector domain; EHV-1, herpes virus equini 1; HCMV, citomegalovirus umano; HPV-16, papilloma virus umano 16; HSV, virus herpes simplex; HVS herpes virus saimiri; KSHV, herpes virus associato al sarcoma di Kaposi; MCV, virus contagioso del mollusco.

Il ruolo delle vie di morte cellulare in immunità

Oltre al suo ruolo nella difesa naturale dell’ospite attraverso l’eliminazione di cellule infette, la morte cellulare programmata gioca una parte importante nel modellare le risposte immuni dell’ospite.  Nonostante il consenso generale sull’apoptosi sul fatto che essa sia immunologicamente tolerogenica mentre la necrosi sia immunogenica, rimangono aperte le domande sul come i diversi modi di morte, particolarmente la necrosi programmata, influenzino le risposte immuni adattive.  Nonostante l’assenza delle vie di morte dipendenti da caspasi-8 e da RIP3, i topi Casp8-/-Rip3-/- montano riposte immuni durante le infezioni virali, così che questi topi forniscono uno strumento per comprendere il contributo all’immunità innata ed adattiva dell’apoptosi estrinseca e dei segnali di pericolo che risultano dalla morte cellulare dipendente dal necrosoma.  Oltre al controllo dell’infezione da MCMV dei topi Casp8-/-Rip3-/-, le infezioni da virus a RNA possono essere controllate da topi ricostituiti con progenitori ematopoietici Fadd-/-Rip1-/- e da topi Rip3-/- in cui le cellule T esprimono un mutante dominante negativo di FADD o non hanno caspasi 8.  Queste osservazioni indicano che le risposte immuni innate di base ed adattive verso patogeni naturali sono sostenute in questi topi nonostante l’assenza dell’apoptosi estrinseca e delle vie di necrosi programmata.  Nei topi Casp8-/-Rip3-/-, l’apoptosi intrinseca è intatta.  Una combinazione di morte intrinseca e di risposte infiammatorie sembra essere adeguata per l’eliminazione delle cellule infette, per l’azione dell’interferone virale e per la presentazione crociata degli antigeni.  Questi eventi sono sufficienti per l’inizio della risposta immune adattiva e per l’eliminazione delle cellule infettate da patogeni da parte delle cellule T attivate, nonostante l’assenza dell’apoptosi estrinseca e della necrosi programmata.  Inoltre, sembra che l’apoptosi intrinseca sia sufficiente per la fase di contrazione della risposta immune, così come per la memoria immunologica.  Sarà importante determinare precisamente le risposte apoptotiche ed infiammatorie che contribuiscono al controllo immune dell’infezione e alla regolazione immune in assenza sia dell’apoptosi dipendente da caspasi 8 che della necrosi dipendente da RIP3, dato il potenziale di entrambe le vie di influenzare l’immunità adattiva.

                Le cellule T esibiscono naturalmente la capacità proliferativa più grande di qualsiasi tipo cellulare dei mammiferi.  Le vie di morte cellulare sono state implicate nell’omeostasi, attivazione e contrazione  delle popolazioni di cellule T.  L’apoptosi dipendente da Fas media l’eliminazione di cellule T in eccesso che si accumulano nel corso della vita.  L’importanza del segnale di Fas nel controllo omeostatico delle cellule T è stato evidente fin da quando sono state inizialmente osservate linfadenopatia, splenomegalia e linfociti CD3+CD4-CD8-B220+ anormali in topi vecchi lpr/lpr (che sono deficienti in FAS) e topi gld/gld (che sono deficienti di Fas ligando).  Un deficit di caspasi 8 o FADD da soli in cellule T non riassume questo fenotipo, anche se talvolta si può notare una modesta linfoproliferazione.  L’accumulazione progressiva di cellule T anormali simili a quelle osservate in topi deficienti nel segnale di FAS si osserva in topi Casp8-/-Rip3-/-, presumibilmente perché l’attivazione di caspasi 8 avviene direttamente a valle di FAS nella via apoptotica.  Difetti simili si osservano in topi che hanno un’alterazione specifica delle cellule T verso una certa varietà di infezioni virali, ma questi indicano chiaramente che la caspasi 8 ha un ruolo cruciale nell’omeostasi delle cellule T a valle di FAS.

                La necroptosi dipendente da RIP1 e RIP3 sottolinea la perdita di cellule T in topi in cui c’è uno scenario di deficienza di caspasi 8 o di FADD.  La risposta delle cellule T viene salvata quando sono eliminati i componenti del necrosoma, e ciò suggerisce che la necroptosi possa regolare la risposta delle cellule T specifica per l’antigene.  E’ possibile estrapolare queste scoperte nella biologia dell’uomo, dove la presenza di caspasi 10 – un paralogo di caspasi 8 non presente nei topi – contribuisce ai risultati insieme a caspasi 8.  E’ interessante notare che i difetti delle cellule T in individui con mutazione di caspasi 8 siano diversi da quelli trovati in individui con mutazione di caspasi 10.  La mutazione di Casp8 determina immunodeficienza, e ciò suggerisce un ruolo nell’inibizione della necroptosi dei linfociti, mentre la deficienza di caspasi 10 determina linfadenopatia, splenomegalia ed autoimmunità, che è maggiormente in linea con un ruolo in apoptosi a valle di FAS.  Inoltre, caspasi 8 e caspasi 10 umane potrebbero avere funzioni sovrapponibili solo in parte durante lo sviluppo embrionale umano, dal momento che individui con mutazioni nei singoli geni danno risultati differenti; si prevede che caspasi 8 controlli apoptosi e necroptosi, mentre probabilmente caspasi 10 è ristretta al solo controllo dell’apoptosi.  Il contributo che i due ortologhi dell’uomo danno alla morte apoptotica e necrotica durante lo sviluppo, la difesa dell’ospite, il cancro, l’immunità e le malattie richiede una valutazione comparativa più stretta.

Conclusioni

E’ chiaro adesso che la necrosi programmata e l’apoptosi hanno ruoli complementari nella difesa dell’ospite contro i patogeni.  Una forma di necrosi programmata, la necroptosi, è dipendente da RIP1 e RIP3 ed è innescata da recettori di morte, PRR, dal TCR o da stress genotossico, così come durante lo sviluppo gestazionale, in scenari in cui l’attività di caspasi 8 è compromessa.  La necroptosi ha un ruolo nella difesa dell’ospite durante l’infezione con patogeni intracellulari che codificano inibitori della caspasi 8, ma contribuisce anche alla patogenesi di malattie nell’infiammazione acuta o cronica indotta da batteri.  Al contrario, la necrosi programmata indotta da MCMV è indipendente da RIP1 ma dipendente da RIP3.  L’MCMV non codifica solo un inibitore della caspasi 8 che sensibilizza le cellule infette alla necrosi programmata, ma anche un inibitore della necroptosi dipendente da RHIM  e della necrosi programmata indotta da MCMV.  L’identificazione della necrosi programmata indotta da MCMV implica l’infezione virale – ed i soppressori virali della morte cellulare – nell’evoluzione della necrosi programmata come meccanismo alternativo nella difesa dell’ospite.

(Tratto da Edward S. Mocarski, Jason W. Upton e William J. Kaiser “Viral infection and the evolution of caspase 8-regulated apoptotic and necrotic Death pathways” Nat rev Immunol, 12; 79-88, 2012)

La spiaggia

Posted in libri with tags , , , , on October 8, 2013 by Domenico Delfino

“…Diverse volte in quell’anno capitai a Genova e sempre andavo a trovarli.  Di rado erano soli, e Doro con la sua disinvoltura pareva benissimo trapiantato nell’ambiente della moglie.  O dovrei dire piuttosto ch’era l’ambiente della moglie che aveva riconosciuto in lui il suo uomo e Doro li lasciava fare, noncurante e innamorato.  Di tanto in tanto prendevano il treno, lui e Clelia, e facevano un viaggio, una specie di viaggio di nozze intermittente, che durò quasi un anno.  Ma avevano il buon gusto di accennarne appena.  Io, che conoscevo Doro, ero lieto di questo silenzio, ma anche invidioso: Doro è di quelli che la felicità rende taciturni, e a ritrovarlo sempre pacato e intento a Clelia, capivo quanto doveva godersi la nuova vita.  Fu anzi Clelia che, quand’ebbe con me un po’ di confidenza, mi disse, un giorno che Doro ci lasciò soli: – Oh si, è contento,- e mi fissò con un sorriso furtivo e incontenibile….”

(Tratto da Cesare Pavese “La Spiaggia”, Meridiani – I Grandi Scrittori, Editoriale Domus)

Follow

Get every new post delivered to your Inbox.