Storia della Calabria

Posted in Calabria, libri with tags , , , , on September 23, 2013 by Domenico Delfino

Dalla Restaurazione all’Unità d’Italia

“…(Il re)…Ripartito alle tre antimeridiane del giorno 11 ottobre ascoltò la messa a Soveria, che per la sua posizione era sulla strada obbligata e spesso aveva assistito al passaggio di regnanti e di personalità…”

(Tratto da Mario Felice Marasco “Storia della Calabria”, Calabria Letteraria Editrice, 1987)

L’applicazione sequenziale di farmaci antitumorali aumenta la morte cellulare re-indirizzando le reti apoptotiche di segnale

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on September 9, 2013 by Domenico Delfino

Riassunto

Le relazioni crociate e la complessità all’interno delle vie di segnale, e la loro alterazione da parte di oncogeni, limita gli approcci su componenti singoli per la comprensione della malattia umana.  L’analisi di reti coinvolte nel come i segnali normali ed oncogenici possano essere re-indirizzati dai farmaci può fornire opportunità per agire con alta specificità ed efficacia sui tumori.  Usando l’inibizione dei bersagli delle vie oncogeniche di segnale in associazione con la chemioterapia da danno al DNA, riportiamo che l’inibizione dell’EGFR scaglionata nel tempo, ma non la co-somministrazione contemporanea, sensibilizza drammaticamente ai farmaci genotossici una sottopopolazione triplo-negativa di cellule del cancro del seno.  L’analisi a livello di sistema – usando misurazioni ad elevata densità dipendenti dal tempo delle reti di segnale, profili di espressione genica, e risposte cellulari fenotipiche in associazione a modelli matematici – ha rivelato un approccio per alterare lo stato intrinseco della cellula attraverso un re-indirizzamento dinamico delle vie oncogeniche di segnale.  Questo processo converte queste cellule ad uno stato meno tumorigenico che è più suscettibile alla morte cellulare indotta dal danno al DNA attraverso la riattivazione di una via apoptotica estrinseca  la cui funzione è soppressa nello stato di dipendenza dall’oncogene.

Introduzione

Le terapie classiche per il trattamento dei tumori maligni umani coinvolgono tipicamente l’uso della chemioterapia e della radioterapia, che funziona danneggiando il DNA sia in cellule normali che cancerose.  Le nostre sempre maggiori conoscenze di questo processo suggeriscono che la risposta al danneggiamento del DNA (DDR) funziona come parte di una complessa rete che controlla molte funzioni cellulari, tra cui il ciclo cellulare, la riparazione del DNA, e varie forme di morte cellulare.  La DDR è altamente interconnessa con altre reti di segnale pro-crescita e pro-morte, che funzionano insieme per controllare il destino della cellula in maniera non lineare a causa di molteplici livelli di controllo retroattivo e di interazioni.  Quindi, è difficile predire a priori come saranno processati dalla cellula segnali molteplici, spesso in conflitto tra loro, particolarmente da parte di cellule maligne, dove le reti regolatorie esistono spesso in forme atipiche.

Predire l’efficacia del trattamento, e il disegno ottimale della terapia di combinazione, richiede una comprensione dettagliata di come il DDR ed altri segnali molecolari sono integrati e processati, come questo processamento è alterato dalle perturbazioni genetiche che si trovano comunemente nei tumori, e come le reti possono essere “re-indirizzate” usando farmaci da soli o in combinazione.

In molte forme di cancro della mammella segnali aberranti ormonali e/o di fattori di crescita giocano ruoli chiave sia nell’induzione dei tumori che nella loro resistenza al trattamento.  Inoltre, l’identificazione di guide molecolari in sottotipi specifici di cancro della mammella ha portato allo sviluppo di forme più efficaci di trattamento mirato.  Nonostante questi avanzamenti, non ci sono attualmente terapie mirate ed eziologie molecolari certe per i cancri della mammella triplo-negativi (TNBC) – una mistura eterogenea  di cancri della mammella definiti solo dall’assenza dell’espressione del recettore per gli estrogeni (ER) e del recettore del progesterone (PR), e dalla mancanza dell’amplificazione dell’oncogene HER2.  I pazienti con TNBC hanno una sopravvivenza senza recidiva più breve ed una prognosi finale peggiore rispetto alle altre pazienti con cancro della mammella, e tuttavia, almeno inizialmente, tendono a rispondere alla chemioterapia genotossica.  Le pazienti tripo-negative generalmente vanno bene se viene ottenuta una risposta patologica completa in seguito alla chemioterapia.  Quando esiste la malattia residua, tuttavia, la prognosi tipicamente è peggiore che per altri sottotipi di cancro della mammella.  Quindi, l’identificazione di nuove strategie per aumentare la chemiosensibilità iniziale dei TNBC può avere dei benefici terapeutici sostanziali.  Ci siamo domandati se un approccio biologico di sistema, centrato sull’esame e la manipolazione dell’interfaccia tra le vie di segnale dei fattori di crescita e le vie di segnale del danno al DNA in cellule tumorali, poteva modulare la risposta terapeutica di questo tipo tumorale recalcitrante.  Qui riportiamo che il pre-trattamento, ma non il co-trattamento o il post-trattamento con inibitori di EGFR di una sottopopolazione di TNBC possono sinergizzare marcatamente la loro risposta apoptotica alla chemioterapia da danno al DNA attraverso un re-indirizzamento dinamico delle reti oncogeni che di segnale  e lo smascheramento di vie pro-apoptotiche soppresse.  Questi risultati hanno ampie implicazioni per l’analisi, il disegno, e l’utilizzazione di terapie di combinazione nel trattamento dei tumori maligni.

Discussione

In questo studio, descriviamo un approccio sistematico tempo e dose dipendente per identificare le combinazioni di farmaci che sono efficaci nell’uccidere cellule cancerose in dipendenza di modificazioni nell’ordine e nella durata dell’esposizione ai farmaci.  Abbiamo trovato che l’inibizione di EGFR sensibilizza drammaticamente una sottopopolazione di TNBC al danno del DNA se i farmaci vengono dati sequenzialmente ma non simultaneamente.  Inoltre, le nostre analisi trascrizionali, proteomiche ed informatiche di reti di segnale e fenotipi in cellule trattate con i farmaci ha rivelato che l’aumentata efficacia del trattamento risulta da un re-indirizzamento dinamico della rete verso una firma oncogenica mantenuta da un segnale EGFR attivo per smascherare i processi apoptotici che coinvolgono l’attivazione di caspasi-8.  L’aumentata sensibilità ad agenti dannosi che abbiamo osservato richiede una inibizione sostenuta dell’EGFR in quanto il fenotipo non risulta con l’inibizione diretta rapida dell’oncogene, ma piuttosto dalla modulazione di una rete trascrizionale guidata dall’oncogene come indicato nel modello in figura 7G.  Inoltre, questi dati suggeriscono che c’è un’attività della via dell’EGFR, piuttosto che dell’espressione per se dell’EGFR, che determina se l’inibizione scaglionata nel tempo  determinerà un’uccisione sinergica.  Dal momento che EGFR può essere attivato attraverso un diverso set di alterazioni genetiche, alcune delle quali non includono necessariamente lo stesso EGFR, queste scoperte mettono in luce il bisogno di comprendere la connettività e le dinamiche della rete.  Al contrario, queste osservazioni suggeriscono che la fosforilazione di EGFR possa costituire un utile biomarcatore di risposta dell’inibizione scaglionata nel tempo in almeno alcuni tipi tumorali che sono guidati da EGFR, inclusi alcuni TNBC e cancri del polmone.

Una conseguenza chiave del rimodellamento dinamico dipendente da erlotinib della rete di DDR è l’attivazione della caspasi-8 in seguito al danno del DNA.  Il meccanismo dell’attivazione della caspasi-8 non è chiaro, dal momento che generalmente si pensa che questa sia specifica dell’apoptosi mediata dal recettore ed innescata da ligandi come il TNF ed il TRAIL.  Altre possibilità includono l’attivazione retroattiva da caspasi-3, che forse coinvolge la caspasi-6; l’attivazione diretta dei recettori di morte attraverso proteine DDR; o un meccanismo autocrino/paracrino che coinvolge un ligando di morte ancora non identificato.  Distinguere tra queste ed altre possibilità sarà l’obiettivo di studi futuri.

Gli effetti della combinazione di farmaci sono complessi, anche per farmaci relativamente specifici come gli inibitori di EGFR.  La nostra comprensione della compensazione e del re-indirizzamento della rete non è al momento sufficiente da consentire predizioni a priori della risposta cellulare, soprattutto in cellule cancerose dove le reti di segnale spesso sono presenti in forme atipiche.  Questo lavoro mette in luce l’utilità dell’esame sperimentale dei trattamenti di combinazioni scaglionati nel tempo per i loro effetti anti-cancro, particolarmente quando sono combinati con un’analisi delle vie di segnale e delle risposte usando modelli matematici.  Questi tipi di approccio possono facilitare l’identificazione di combinazioni farmacologiche efficaci e di nuovi bersagli terapeutici, ed il disegno di tipi diversi di studi clinici, per studiare l’uccisione di tumori dipendenti da oncogeni attraverso il re-indirizzamento dinamico indotto dai farmaci delle vie di segnale.

(Tratto da Michael J. Lee, Albert S. Ye, Alexandra K. Gardino, Anne Margriet Heijink, Peter K. Sorger, Gavin MacBeath, Michael B. Yaffe “Sequential application of anti-cancer drugs enhances cell Death by re-wiring apoptotic signaling networks”, Cell 2012;149:780-794)

Caspasi-8 previene l’attivazione dell’inflammasoma

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on September 6, 2013 by Domenico Delfino

La caspasi-8 ha ruoli molteplici: promuove l’apoptosi estrinseca; inibisce l’attivazione dell’Interferon-regulatory factor 3 (IRF3) a valle del sensore degli acidi nucleici virali RIG-I; e blocca la formazione del ripoptosoma – un complesso che contiene receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1; anche conosciuta come RIP1), RIPK3 e la proteina adattatrice FADD ed inizia la necrosi programmata.  Adesso, Wallach e colleghi descrivono un ruolo aggiuntivo della caspasi-8 e del ripoptosoma nell’inibizione dell’inflammasoma NLRP3.

                Gli autori hanno generato topi transgenici che non hanno l’espressione di caspasi-8 specificamente in cellule dendritiche (DC), e hanno usato questi topi (che hanno chiamato topi C8-) per studiare il ruolo di caspasi-8 nella regolazione del segnale immune.  Sorprendentemente, i topi C8- hanno mostrato una aumentata suscettibilità alla morte indotta la lipopolisaccaride (LPS) in paragone ai topi normali.  La mortalità dei topi C8- in seguito a somministrazione di LPS era preceduta da elevazione dei livelli serici di interleuchina-1β (IL-1β) e poteva essere prevenuta dall’iniezione di un antagonista del recettore dell’IL-1.  Inoltre, necrostatina 1 (che è un inibitore di RIPK1) o una deficienza di RIPK3 prolungava la sopravvivenza dei topi C8- trattati con LPS.  Queste scoperte implicano che caspasi-8 ed il ripoptosoma sono coinvolti nella regolazione dello shock endotossico dipendente da IL-1β.

                L’IL-1β è prodotta in un processo a due fasi.  Prima, componenti microbici istruiscono le DC ad esprimere la pro-IL-1β ed alcuni componenti dell’inflammasoma e, secondo, i segnali di pericolo come l’ATP promuovono l’assemblaggio dell’inflammasoma e la maturazione dell’IL-1β mediata dalla caspasi-1.  Tuttavia, le DC Casp8-/- provenienti da topi C8- producevano IL-1β in risposta a componenti microbici isolati – senza la necessità di una stimolazione secondaria con ATP o con detriti cellulari apoptotici – in maniera dipendente da RIPK1 e RIPK3.  E’ degno di nota che la deficienza di caspasi-8 non aumentava l’espressione di pro-IL-1β o dei componenti dell’inflammasoma NLRP3.  Invece, promuoveva l’assemblaggio della proteina adattatrice ASC e di NLPR3 con pro-caspasi-1 per formare un inflammasoma attivo.

                Per di più, né la morte cellulare né la produzione di specie reattive dell’ossigeno (che sono state implicate nell’attivazione dell’inflammasoma) erano coinvolte nell’attivazione dell’inflammasoma NLPR3 da parte dell’LPS nelle DC Casp8-/-.  Allo stesso modo, livelli comparabili di ATP erano rilasciati da DC sia normali che Casp8-/- non stimolate o stimolate con LPS.  Tuttavia, differentemente da DC normali, l’LPS induceva l’assemblaggio del ripoptosoma in DC Casp8-/-.  In aggiunta, è stato trovato che la protein chinasi MLKL e la protein fosfatasi PGAM5, che sono coinvolte nella necrosi programmata, sono essenziali per la produzione di IL-1β in DC Casp8-/- trattate con LPS.  Quindi, il ripoptosoma ed i suoi effettori a valle sono coinvolti non solo nell’induzione della necrosi programmata, ma anche nell’attivazione dell’inflammasoma NLRP3, ed esperimenti con l’inibitore pan-caspasico indicano che l’attività di caspasi diverse dalla caspasi-8 bloccano il primo dei due processi.

                Infine, Il trattamento con LPS di DC normali promuoveva l’associazione di caspasi-8 con FADD (per inibire l’assemblaggio e la funzione del ripoptosoma) ma anche con l’inflammasoma, il chè implica un meccanismo di regolazione a due facce.  Gli autori propongono che caspasi-8 sia un controllore multivalente del segnale dell’immunità innata, in quanto inibisce l’attivazione dell’inflammasoma in DC, l’attivazione di IRF3 e la morte cellulare pro-infiammatoria.

papa 1

(Tratto da Maria Papatriantafyllou “Caspase-8 prevents inflammasome activation”, Nat Rev Immunol, 2013; 13)

Riconciliare il doppio ruolo di caspasi-8 nella morte e nella proliferazione cellulare

Posted in Biomedical Research with tags , , , on August 30, 2013 by Domenico Delfino

Prefazione

Caspasi-8 può innescare l’apoptosi, ma è anche necessaria per lo sviluppo embrionale e per la proliferazione delle cellule immuni.  Mentre sono stati proposti molti ruoli non apoptotici per caspasi-8, un recente lavoro ha indicato che la richiesta di caspasi-8 nello sviluppo e nella proliferazione è definita dalla soppressione di RIPK3, una chinasi che può innescare una forma alternativa di morte cellulare chiamata necrosi programmata.  Considereremo queste scoperte recenti, e come si possono riconciliare con i lavori precedenti sul ruolo non apoptotico di caspasi-8.

Introduzione

Caspasi-8 è una proteasi a cisteina che inizia l’apoptosi in risposta a recettori sulla superficie cellulare.  Questo processo, conosciuto come “apoptosi estrinseca”, è mediata da un gruppo di recettori della superfamiglia del Tumor Necrosis Factor (TNF) chiamati recettori di morte (DR).  Questi includono il recettore-1 del TNF (TNFR1) ed il recettore correlato CD95 (conosciuto anche come Fas e APO-1).  L’attivazione dei DR può portare a morte cellulare, ma anche a proliferazione ed aumentata attivazione di NF-kB, come discuteremo dopo.  Per innescare la morte cellulare, i DR reclutano una proteina adattatrice, Fas associated protein with a death domain (FADD), con le loro code citoplasmatiche; FADD quindi recluta i proenzimi caspasi-8 e li attiva inducendone la dimerizzazione, e portando all’attivazione caspasica e all’apoptosi (vedi il box 1 e la figura 1).  L’attivazione apoptotica della caspasi-8 è prevenuta da un’altra proteina, FLICE-like inhibitory protein long (cFLIPL, da qui in avanti chiamata semplicemente FLIP), che è omologa della caspasi-8 ma non ha i residui catalitici.  Quindi FLIP è capace di formare un eterodimero inibitorio con caspasi-8 che limita l’induzione dell’apoptosi (Box 1).  Noi, di seguito, rivisiteremo le proprietà dell’eterodimero caspasi-8-FLIP.

La morte cellulare apoptotica è un mezzo per eliminare cellule superflue o danneggiate, e di conseguenza, l’assenza di espressione di proteine coinvolte nell’apoptosi porta spesso a difetti associati con una sovrabbondanza di cellule.  E’ quindi sorprendente che la mancata espressione di caspasi-8 nel topo, così come quella di FADD o FLIP, porta a letalità embrionale, a mancata vascolarizzazione del sacco vitellino e ad assenza dell’ematopoiesi che si osservano intorno al giorno E10.5 di sviluppo.  Questa osservazione porta all’ipotesi che queste proteine giochino un ruolo in altri processi cellulari accanto all’apoptosi.  La delezione condizionale di FADD o di caspasi-8 nei tessuti linfoidi rinforza quest’idea: cellule T deficienti dell’una o dell’altra proteina – mentre sono resistenti all’apoptosi indotta dalla stimolazione di CD95 – non riescono a proliferare in seguito a stimolazione del recettore delle cellule T (TCR).  La necessità di caspasi-8 e FADD per la proliferazione cellulare è stata estesa alle cellule B stimolate con ligandi dei recettori Toll-like (TLR) 3 e 4.  Sono stati impiegati molti studi e molti sforzi per spiegare queste osservazioni, e sono stati assegnati molti ruoli non apoptotici a caspasi-8, FADD e FLIP.  E’ stato riportato che tutte e tre sono coinvolte nell’attivazione di NF-kB, ed è stato proposto che ciò potesse spiegare i difetti proliferativi delle cellule T e B difettivi di caspasi-8.  Inoltre la caspasi-8 è stata implicata nella motilità cellulare, nelle metastasi, e nella soppressione dell’infiammazione, mentre è stato riportato che FADD è necessario per la normale progressione del ciclo cellulare.

Molti anni fa, è stato osservato che, in cellule in coltura in cui caspasi-8 o FADD sono assenti o inibite, il trattamento con TNF causa una forma non apoptotica di morte cellulare che coinvolge rigonfiamento e rottura delle cellule, caratteristiche comunemente associate a morte cellulare necrotica (piuttosto che a quella apoptotica).  Come nell’apoptosi, è stato visto che questa forma alternativa di morte cellulare è “programmata”, in quanto dipende dall’attivazione di specifici enzimi cellulari: Receptor Interacting Protein Kinase-1 (RIPK1) e RIPK3.  Queste osservazioni hanno portato all’idea che i ruoli non apoptotici di FADD e caspasi-8 possano coinvolgere la soppressione della necrosi programmata dipendente da RIPK3.  Recentemente quest’idea ha ricevuto un forte supporto genetico, con la scoperta che la concomitante ablazione di RIPK1 e RIPK3 salvava dai difetti di sviluppo ed immuni associati con la deficienza di FADD e di caspasi-8.  Qui, verranno riassunti i lavori recenti che implicano la soppressione del segnale di RIPK come il ruolo non apoptotico principale di caspasi-8.  Saranno quindi rivisitati e prudentemente reinterpretati nel contesto del segnale di RIPK, alcuni ruoli non apoptotici di caspasi-8, FADD, e FLIP proposti precedentemente.

La figura descrive l’attivazione di caspasi-8 nel DISC associato al recettore; tuttavia, eventi simili di omo- ed eterodimerizzazione sono presenti nel complesso associato a RIPK1 descritto in Fig. 2.  A) i zimogeni inattivi di caspasi-8 sono presenti nel citosol della maggior parte delle cellule sane.  Questi sono composti da un prodominio (celeste), e da una subunità grande ed una piccola (verde e blu, rispettivamente).  B) il legame dei recettori della superficie cellulare come CD95 porta al reclutamento dell’adattatore FADD, che a sua volta recluta i zimogeni monomerici di caspasi-8 presenti nel citosol attraverso le interazioni con il prodominio di caspasi-8.  C) Quando i livelli di FLIP sono bassi, questo reclutamento porta alla omodimerizzazione, che è seguita dal taglio delle regioni di legame tra i domini.  Questi eventi di taglio stabilizzano l’omodimero e consentono la formazione dei siti proteolitici attivi, simbolizzati da stelle.  D) L’omodimero di caspasi-8 pienamente attivo può quindi trasdurre il segnale apoptotico attivando le caspasi a valle, o tagliando ed attivando il membro Bid della famiglia Bcl-2.  E) Quando i livelli di FLIP sono alti (per es., in seguito all’attivazione di NF-kB da parte del complesso I associato al TNFR1; vedi il Box 2), la caspasi-8 recluta preferibilmente ed omodimerizza con FLIP.  Il complesso eterodimerico caspasi-8-FLIP è cataliticamente attivo, ed, importante, FLIP può attivare caspasi-8 in assenza degli eventi di taglio interdominio.  L’attività del complesso caspasi-8-FLIP non innesca l’apoptosi, ed è responsabile della soppressione del segnale RIPK1-RIPK3.  Tuttavia, deve ancora essere chiarito quali sono i substrati chiave di questo complesso, e come FLIP limita l’attivazione di caspasi-8 in vivo.

Figura 1: la figura descrive l’attivazione di caspasi-8 nel DISC associato al recettore; tuttavia, eventi simili di omo- ed eterodimerizzazione sono presenti nel complesso associato a RIPK1 descritto in Fig. 2. A) i zimogeni inattivi di caspasi-8 sono presenti nel citosol della maggior parte delle cellule sane. Questi sono composti da un prodominio (celeste), e da una subunità grande ed una piccola (verde e blu, rispettivamente). B) il legame dei recettori della superficie cellulare come CD95 porta al reclutamento dell’adattatore FADD, che a sua volta recluta i zimogeni monomerici di caspasi-8 presenti nel citosol attraverso le interazioni con il prodominio di caspasi-8. C) Quando i livelli di FLIP sono bassi, questo reclutamento porta alla omodimerizzazione, che è seguita dal taglio delle regioni di legame tra i domini. Questi eventi di taglio stabilizzano l’omodimero e consentono la formazione dei siti proteolitici attivi, simbolizzati da stelle. D) L’omodimero di caspasi-8 pienamente attivo può quindi trasdurre il segnale apoptotico attivando le caspasi a valle, o tagliando ed attivando il membro Bid della famiglia Bcl-2. E) Quando i livelli di FLIP sono alti (per es., in seguito all’attivazione di NF-kB da parte del complesso I associato al TNFR1; vedi il Box 2), la caspasi-8 recluta preferibilmente ed omodimerizza con FLIP. Il complesso eterodimerico caspasi-8-FLIP è cataliticamente attivo, ed, importante, FLIP può attivare caspasi-8 in assenza degli eventi di taglio interdominio. L’attività del complesso caspasi-8-FLIP non innesca l’apoptosi, ed è responsabile della soppressione del segnale RIPK1-RIPK3. Tuttavia, deve ancora essere chiarito quali sono i substrati chiave di questo complesso, e come FLIP limita l’attivazione di caspasi-8 in vivo.

TNF: complessi e complessità

Nel considerare come caspasi-8 possa esercitare la soppressione del segnale RIPK, dobbiamo prima discutere sulla natura pleiotropica del segnale per mezzo della citochina TNF.  E’ importante il fatto che attualmente non ci sono evidenze genetiche che i difetti osservati negli animali deficienti di caspasi-8 o FADD siano dovuti al segnale del TNF.  Nonostante ciò, il segnale TNF rappresenta il quadro più chiaro all’interno del quale considerare le vie interconnesse di attivazione dell’NF-kB, apoptosi, e necrosi programmata.

Gli eventi iniziali che seguono il legame al recettore del TNF sono già state estensivamente oggetto di rassegne, e sono riassunti nel Box 1.  E’ importante per questo argomento che alla fine, RIPK1 sia reclutato nel complesso recettoriale (chiamato “complesso I”), ed il programma trascrizionale di NF-kB sia attivato.  FLIP è un bersaglio trascrizionale di NF-kB, e l’aumentata espressione di FLIP è responsabile della natura non apoptotica della risposta al TNF in molti tipi cellulari; se l’aumento dell’espressione di FLIP è bloccato, il TNF diviene potentemente pro-apoptotico.  Come sarà discusso in seguito, FLIP è implicato anche nella soppressione da parte della caspasi-8 del segnale dipendente da RIPK3, e perciò rappresenta un legame funzionale tra il segnale di NF-kB e la prevenzione sia dell’apoptosi che della necrosi dipendente da RIPK3. (Fig. 2)

In seguito alla formazione del complesso I, RIPK1 trasloca in un secondo complesso citosolico (Complesso II).  Questa traslocazione dipende dalla deubiquitinazione di RIPK1 da parte della deubiquitinasi CYLD, ed il complesso II è stato inizialmente descritto come un sito dell’attivazione apoptotica di caspasi-8.  Tuttavia, quando è divenuto evidente che RIPK1 attiva anche RIPK3 per guidare la necrosi programmata, e che questo segnale poteva essere bloccato da caspasi-8, il complesso II è stato rivisto come sito chiave dell’interazione tra la via RIPK1-RIPK3 e FADD, caspasi-8, e FLIP (Fig. 2).

Due recenti lavori presentano evidenze stringenti del fatto che si possa formare nel citosol un complesso che contiene RIPK1 capace di reclutare RIPK3, FADD, caspasi-8 e FLIP indipendentemente dall’attivazione recettoriale in risposta a molteplici segnali cellulari e agli stress (Box 3).  Questi studi indicano che questo complesso rappresenta un “modulo” di segnale che è capace di attivare sia l’apoptosi (attraverso la caspasi-8) che la necrosi programmata (attraverso RIPK3), e può essere reclutato da molteplici piattaforme di segnale tra cui TNFR o l’adattatore del TLR TRIF.  Queste scoperte suggeriscono che l’equilibrio tra caspasi-8, FLIP ed il segnale RIPK può determinare il destino della cellula in risposta a molti tipi diversi di segnali cellulari e stress, un concetto sul quale ritorneremo.

Il reclutamento di caspasi-8 e FLIP nel complesso che contiene RIPK1 determina il destino della cellula.  Questa figura descrive la formazione del complesso II che contiene RIPK1 e che attiva RIPK3 in seguito al legame del TNFR1; tuttavia, evidenze recenti indicano che un complesso simile può essere indotto dal legame di TLR-3 o -4 o da stress genotossico.  Il legame di TNFR1 all’inizio innesca l’attivazione di NF-kB e l’aumento della trascrizione di FLIP (vedi Box 2).  RIPK1 viene quindi deubiquitinato e trasloca nel citosol, dove può reclutare FADD, caspasi-8, e/o FLIP in maniera analoga a quanto descritto in fig. 1.  RIPK1 può anche reclutare ed attivare RIPK3 in questo complesso, un processo che è controllato da FADD, caspasi-8 e FLIP.  A) Quando sia caspasi-8 che FLIP sono presenti, queste proteine sono reclutate nel complesso che contiene RIPK1.  L’eterodimero caspasi-8-FLIP limita il segnale RIPK1-RIPK3, ma non innesca l’apoptosi.  E’ importante sapere che il meccanismo attraverso cui la soppressione del segnale di RIPK1-RIPK3 da parte del complesso caspasi-8-FLIP viene attuata rimane tuttora controverso.  B) Quando i livelli di FLIP sono bassi (per esempio, se il segnale di NF-kB viene inibito), l’attivazione di caspasi-8 è incontrollata, e porta ad apoptosi.  FLIP è necessario non solo per limitare l’attivazione di caspasi-8, ma anche per sopprimere il segnale RIPK, di modo che ridotti livelli di FLIP possono anche sensibilizzare le cellule alla necrosi dipendente da RIPK3 se l’apoptosi è inibita.  C) Quando caspasi-8 (o FADD) è assente, l’attivazione apoptotica di caspasi-8 è impossibile, ma il segnale RIPK procede incontrollato.  Il risultato è la sensibilizzazione alla necrosi programmata dipendente da RIPK3.

Figura 2: Il reclutamento di caspasi-8 e FLIP nel complesso che contiene RIPK1 determina il destino della cellula. Questa figura descrive la formazione del complesso II che contiene RIPK1 e che attiva RIPK3 in seguito al legame del TNFR1; tuttavia, evidenze recenti indicano che un complesso simile può essere indotto dal legame di TLR-3 o -4 o da stress genotossico. Il legame di TNFR1 all’inizio innesca l’attivazione di NF-kB e l’aumento della trascrizione di FLIP (vedi Box 2). RIPK1 viene quindi deubiquitinato e trasloca nel citosol, dove può reclutare FADD, caspasi-8, e/o FLIP in maniera analoga a quanto descritto in fig. 1. RIPK1 può anche reclutare ed attivare RIPK3 in questo complesso, un processo che è controllato da FADD, caspasi-8 e FLIP. A) Quando sia caspasi-8 che FLIP sono presenti, queste proteine sono reclutate nel complesso che contiene RIPK1. L’eterodimero caspasi-8-FLIP limita il segnale RIPK1-RIPK3, ma non innesca l’apoptosi. E’ importante sapere che il meccanismo attraverso cui la soppressione del segnale di RIPK1-RIPK3 da parte del complesso caspasi-8-FLIP viene attuata rimane tuttora controverso. B) Quando i livelli di FLIP sono bassi (per esempio, se il segnale di NF-kB viene inibito), l’attivazione di caspasi-8 è incontrollata, e porta ad apoptosi. FLIP è necessario non solo per limitare l’attivazione di caspasi-8, ma anche per sopprimere il segnale RIPK, di modo che ridotti livelli di FLIP possono anche sensibilizzare le cellule alla necrosi dipendente da RIPK3 se l’apoptosi è inibita. C) Quando caspasi-8 (o FADD) è assente, l’attivazione apoptotica di caspasi-8 è impossibile, ma il segnale RIPK procede incontrollato. Il risultato è la sensibilizzazione alla necrosi programmata dipendente da RIPK3.

RIPK3 & Caspasi-8: Evidenze genetiche

RIPK3 è altamente espresso nel tessuto linfoide dell’adulto, e la prima forte evidenza che la soppressione della necrosi programmata poteva definire il ruolo non apoptotico di caspasi-8 è stata ottenuta nelle cellule T.  Studi iniziali hanno accertato che cellule T deficienti di caspasi-8 non si accumulavano a causa di un difetto proliferativo; tuttavia, studi successivi hanno mostrato che queste cellule proliferavano normalmente, ma non si accumulavano a causa di un ritmo aumentato di morte cellulare.  E’ stato trovato che questa morte cellulare, in maniera cruciale, era non apoptotica, e la proliferazione poteva essere ristabilita in vitro dalla somministrazione dell’inibitore Nec1 di RIPK1.

Scoperte successive hanno mostrato che la concomitante ablazione di caspasi-8 e RIPK3 salvava completamente dai difetti associati alla deficienza di caspasi-8 – topi senza caspasi-8 e RIPK3 nascono con la frequenza mendeliana attesa e non mostrano un fenotipo evidente.  Come ci si attendeva, questi animali sono resistenti agli effetti letali del legame del CD95 in vivo.  Inoltre, le loro cellule T proliferano e successivamente vengono reclutate normalmente quando sono attivate in vivo da un superantigene batterico.  Appena invecchiano, gli animali mancanti sia di caspasi-8 che di RIPK3 mostrano un disordine linfoaccumulativo simile a quello osservato in topi con mutazioni inattivanti di CD95 o del suo ligando, caratterizzati da accumulo di una popolazione aberrante di cellule linfoidi CD3+B220+CD4-CD8-.  Lavori ulteriori hanno mostrato che la delezione specifica di caspasi-8 in cellule T su un sostrato genetico deficiente di RIPK3 riassume questo disordine, indicando che questa popolazione cellulare deriva dalla linea cellulare T.  Tuttavia, gli eventi selettivi che portano a questa popolazione devono ancora essere chiariti.

Animali deficienti in FADD mostrano difetti di sviluppo e difetti delle cellule immuni simili a quelli osservati in topi senza caspasi-8.  Lavori iniziali  con una ricombinasi Cre inducibile hanno mostrato che la delezione di FADD nel midollo osseo porta ad una drammatica diminuzione in precursori ematopoietici, così come ad un’alterata capacità di generare sia cellule linfoidi che mieloidi.  Lavori successivi hanno trovato che la concomitante ablazione di RIPK1 previene la letalità embrionale precoce osservata in animali deficienti in FADD.  La mancanza di RIPK1 da sola causa mortalità perinatale, ed anche l’animale senza FADD e RIPK1 muore presto dopo la nascita, e ciò preclude ulteriori analisi degli adulti deficienti in FADD.

FLIPping lo scambio di sopravvivenza

Qualsiasi discussione sul ruolo non apoptotico di caspasi-8 deve affrontare il problema del come la proteasi è attivata in un contesto non apoptotico.  Dato che caspasi-8 è una proteasi la cui attivazione porta a morte cellulare apoptotica, come fa la sua attività proteolitica a sopprimere il segnale RIPK3 senza causare apoptosi?

E’ intrigante che mentre FLIP inibisce l’attivazione apoptotica di caspasi-8 attraverso la formazione di eterodimeri con il proenzima caspasi-8 (Box 1, Figura 1), l’eterodimero risultante caspasi-8-FLIP possieda attività catalitica.  Studi In vitro e strutturali hanno trovato che gli eterodimeri caspasi-8-FLIP si formano più velocemente degli omodimeri di caspasi-8, in quanto FLIP ha una maggiore affinità per il proenzima caspasi-8 rispetto allo stesso proenzima.  Questa proprietà consente a FLIP di attivare caspasi-8 anche in assenza di eventi di autoclivaggio tra domini che sono necessari per la stabilizzazione e l’attività dell’omodimero di caspasi-8.  Ciò è importante dal momento che la scoperta di un topo che esprime soltanto una versione non-tagliabile di caspasi-8 mostra un normale sviluppo ed attivazione di cellule immuni, ma le cellule e i tessuti di questi topi sono resistenti all’apoptosi.  Quindi, la caspasi-8 non tagliabile – che può essere attivata dall’eterodimerizzazione con FLIP, ma non dall’omodimerizzazione – può portare avanti le funzioni non apoptotiche di caspasi-8.  La ricostituzione di cellule MEF deficienti di caspasi-8 con la caspasi-8 originale o quella non tagliabile ha confermato che caspasi-8 non tagliabile è capace di sopprimere la necrosi dipendente da RIPK3, ma ciò richiede la presenza di FLIP (Fig. 2).

Questo lavoro indica che caspasi-8 ha delle porzioni distinte con funzioni diverse: l’omodimero di caspasi-8 causa apoptosi, e l’eterodimero caspasi-8-FLIP cataliticamente attivo, la cui attività sopprime il segnale di RIPK3 e media il ruolo non apoptotico di caspasi-8 (Figura 2).  E’ importante che sia stato trovato che, quando l’apoptosi è bloccata a valle dell’attivazione di caspasi-8, FLIP sia nonostante ciò necessario per prevenire la necrosi dipendente da RIPK3.  Poiché FLIP è un bersaglio trascrizionale di NF-kB, questo lavoro identifica l’aumentata espressione di FLIP come meccanismo chiave attraverso cui il segnale di NF-kB previene sia l’apoptosi che l’attivazione di RIPK3 (Fig. 2).  Tuttavia, il meccanismo attraverso cui il complesso caspasi-8-FLIP sopprime il segnale RIPK è al momento sconosciuto.  Sia RIPK1 che RIPK3 sono stati descritti come substrati di caspasi-8, ed uno studio recente ha mostrato che un mutante tagliato di RIPK1 potrebbe innescare la necrosi anche in presenza di attività di caspasi-8.  Un altro recente studio ha identificato la deubiquitinasi CYLD come substrato chiave di caspasi-8 nella prevenzione della necrosi dipendente da RIPK, anche se il complesso in cui avviene il taglio in vivo deve essere ancora chiarito (Box 3).

Il trattamento su esposto del segnale di FLIP ha considerato solo l’isoforma lunga di FLIP; tuttavia, esiste anche una versione corta di FLIP (FLIPS), composta dal solo prodominio.  FLIPS può inibire l’attivazione di caspasi-8 in maniera dominante negativa competendo per il suo legame con FADD, ma non possiede la capacità di attivare caspasi-8 attraverso eterodimerizzazione.  Consistente con il modello proposto precedentemente, FLIPS non è capace di sopprimere l’attivazione di RIPK.  Questa distinzione è importante in quanto molti virus codificano per proteine anti-apoptotiche omologhe a FLIPS, e la necrosi programmata è stata implicata nelle risposte anti-virali.

Caspasi-8: ruoli al di là dell’apoptosi

I dati presentati precedentemente conferiscono un forte supporto genetico alle funzioni non apoptotiche di caspasi-8 e FADD in dipendenza dalla soppressione delle vie di segnale RIPK1-RIPK3.  Alla luce di queste scoperte, è utile considerare alcuni ruoli non apoptotici precedentemente assegnati a caspasi-8 e FADD.

Segnale NF-kB

Molti rapporti hanno puntato a spiegare i difetti osservati in embrioni e cellule immunitarie deficienti di caspasi-8, FADD o FLIP implicando queste proteine con l’induzione del segnale di NF-kB (Box 2).  E’ stato mostrato che l’attività catalitica di caspasi-8 è necessaria per l’attivazione di NF-kB in cellule T stimolate dall’antigene, ed è stato anche trovato che caspasi-8 si associa con il complesso CARMA-Bcl10-MALT-1, che è necessario all’attivazione di NF-kB in seguito al legame del recettore per l’antigene di cellule T e B.  Inoltre è stato mostrato che caspasi-8 interagisce direttamente con i membri della famiglia TRAF, che promuove la traslocazione di caspasi-8 nei raft lipidici, e lavori ulteriori hanno implicato i raft lipidici come il sito di formazione del complesso caspasi-8-FLIP e la sua associazione con molte proteine coinvolte nell’attivazione di NF-kB.  D’altronde, anche FLIP è stato implicato nell’attivazione di NF-kB, con un certo numero di studi che hanno indicato che uno o più dei frammenti di taglio di FLIP generati dall’associazione con caspasi-8 sono coinvolti nell’attivazione di NF-kB.  Deve essere usata una certa prudenza nell’interpretazione di questi studi, dal momento che presentano lavori sia da sistemi umani che murini.  Diversamente dai topi, gli uomini posseggono l’omologo stretto della caspasi-8, la caspasi-10, che dimostra proprietà regolatorie e funzionali distinte da caspasi-8.  Rimane un problema aperto il come le recenti scoperte nei sistemi murini si possano tradurre nei modelli umani.

Nonostante ciò, l’idea che caspasi-8 giochi un ruolo nell’attivazione di NF-kB ha incontrato recentemente qualche favore.  La tempistica ed i tessuti coinvolti nella letalità embrionale dei topi deficienti di caspasi-8 sono distinti da quelli osservati nei topi deficienti di NF-kB – questi ultimi muoiono intorno ai giorni E13-14 a causa di difetti epatici.  Inoltre, cellule doppie deficienti di caspasi-8-RIPK3 proliferano normalmente, senza nessuno dei difetti osservati in cellule T che non hanno i componenti di NF-kB, Bcl10, CARMA-1 o MALT-1.  Infatti un’analisi attenta ha indicato che le cellule T deficienti di caspasi-8 hanno una normale attivazione di NF-kB, e che i difetti associati a deficienza di caspasi-8 (proliferazione iniziale seguita da morte necrotica) sono distinti da quelli osservati in cellule che non hanno il segnale NF-kB (mancanza di proliferazione).  Allo stesso modo queste scoperte sollevano problemi sul ruolo proposto per FLIP tagliato da caspasi-8 nell’attivazione di NF-kB, dal momento che la deficienza di caspasi-8 dovrebbe presumibilmente abolire queste specie proteiche.  Infatti, un’attenta analisi di cellule T e B deficienti in FLIP ha rivelato che, mentre entrambi i tipi cellulari dimostravano un’aumentata suscettibilità alla morte cellulare, il segnale di NF-kB rimaneva integro.

Oltre l’attivazione delle cellule T, è stato riportato che sia caspasi-8 che FADD sono anche necessari per l’attivazione di NF-kB e la proliferazione di cellule B, in risposta ad un pattern innato di riconoscimento dei recettori TLR3 e TLR4.  Nel considerare il ruolo di FADD e caspasi-8 in questo contesto, è interessante notare che sia TLR3 che TLR4 segnalano attraverso la proteina adattatrice TRIF.  Questa proteina contiene un dominio RIP Homotypic Interaction Motif (RHIM), ed è capace di reclutare RIPK1 e RIPK3; è stato anche riportato che innesca l’apoptosi dipendente da FADD e caspasi-8.  Un recente rapporto indica che un complesso che contiene RIPK1 capace di innescare sia apoptosi che necrosi dipendente da RIPK3 è reclutato da TRIF in seguito a legame di TLR-3.  Questo rapporto mostra anche la presenza di FLIP in questo complesso, e la necessità di questa molecola per limitare l’attivazione di caspasi-8 e sopprimere la necrosi dipendente da RIPK3.  Tutto considerato, questo lavoro implica fortemente che la necessità di FADD, caspasi-8, e FLIP nel segnale TLR è definita per mezzo della soppressione di RIPK3.

Caspasi-8 ed infiammazione

Molti rapporti hanno implicato la caspasi-8 nella soppressione dell’infiammazione.  All’inizio è stato osservato che, in topi in cui caspasi-8 è stata deleta in modo condizionale negli epatociti, un’epatectomia parziale portava ad una risposta proliferativa brusca seguita da infiammazione cronica del fegato.  In seguito, è stato trovato che la delezione condizionale della caspasi-8 in cheratinociti basali portava ad una malattia cutanea infiammatoria severa e fatale, che poteva migliorare parzialmente con il silenziamento del TNF.  Cellule epidermiche deficienti di caspasi-8 mostravano aumentati segnali infiammatori in risposta a DNA trasfettato, il chè ha sollevato la possibilità che caspasi-8 possa funzionare nella soppressione di una via infiammatoria a valle di un sensore nucleotidico innato.  Studi successivi con infezione da virus sendai come modello sperimentale hanno mostrato che caspasi-8 sopprime l’attivazione del fattore di trascrizione pro-infiammatorio IRF-3 attraverso il sensore citosolico di RNA RIG-I.  In maniera significativa, veniva mostrato che questa soppressione era mediata dal taglio di RIPK1, che è reclutato in un complesso che contiene RIG-I ed il suo adattatore, MAVS (Box 3).

Di nuovo, il fenotipo del doppio silenziato caspasi-8:RIPK3 deve essere preso in considerazione.  Differentemente dall’infiammazione epidermica grave osservata in cute specificamente silenziata in caspasi-8, cute da animali con doppio silenziamento caspasi-8-RIPK3 era completamente normale.  Ciò implica che qualsiasi sia il difetto che provoca l’infiammazione in assenza di caspasi-8, esso è corretto dalla rimozione di RIPK3.  E’ intrigante che anche l’ablazione epidermica del segnale di NF-kB causi un’infiammazione severa.  FLIP connette il segnale di NF-kB alla soppressione della via RIPK1-RIPK3 attraverso caspasi-8; emerge quindi la possibilità che la comunanza tra la delezione epiteliale di caspasi-8 ed il segnale di NF-kB potrebbe essere dovuta alla disregolazione del segnale RIPK1-RIPK3.

Anche scoperte recenti in un altro modello epiteliale – l’intestino – supportano queste idee.  Questo studio ha trovato che la delezione di FADD nell’intestino porta a malattia infiammatoria intestinale, un effetto che veniva eliminato dalla concomitante ablazione di RIPK3.  In maniera importante, anche il fenotipo infiammatorio associato alla delezione di FADD veniva migliorato dalla delezione di TNF, dell’adattatore immune innato Nyd88, o dall’eliminazione della flora batterica intestinale.  In modo simile al modello cutaneo discusso prima, questa scoperta presenta lo spettro di un segnale RIPK non ristretto che porta ad una risposta infiammatoria dai molti aspetti, auto-rinforzantesi, con il segnale del TNF e la rottura della barriera intestinale come contributori.  In questo contesto ci si aspetterebbe che la delezione di NF-kB sensibilizzasse le cellule non solo agli effetti dipendenti da RIPK3, ma anche all’apoptosi – un esito che ovviamente caspasi-8 o FADD dovrebbero prevenire.  Infatti, è stato trovato che la delezione di CYLD – che è necessaria per l’attivazione di RIPK a valle del TNF – preveniva l’infiammazione causata dalla delezione intestinale di FADD, ma non del segnale di NF-kB.  Ciò implica che sia l’apoptosi che la necrosi dipendente da RIPK contribuiscano agli effetti infiammatori della delezione di NF-kB; analizzare questi effetti in un tessuto che non sia l’intestino, dove qualsiasi tipo di morte cellulare può causare una rottura della barriera e quindi infiammazione severa,  sarà informativo nel delineare la contribuzione infiammatoria relativa della morte cellulare apoptotica e necrotica.

Considerazioni conclusive

Il lavoro recente ha fornito forti evidenze genetiche all’idea che la soppressione del segnale RIPK1-RIPK3 definisce i ruoli non apoptotici di FADD e caspasi-8.  Poiché caspasi-8, FADD e FLIP sono capaci di sopprimere la necrosi programmata mediata da RIPK1-RIPK3 in cellule in coltura, si può provare a concludere che la prevenzione della necrosi programmata definisce il ruolo non apoptotico di queste proteine.  Tuttavia, siccome le vie della necrosi programmata sono poco comprese, tutto ciò che si può dire sicuramente è che la morte degli embrioni deficienti di caspasi-8 è dipendente da RIPK3; quali processi cellulari sono mediati da RIPK3 in questo contesto, e quali eventi di segnale li innescano, ancora non si sa.  I ruoli conosciuti di RIPK1 e RIPK3 nel segnale del TNF e dell’immunità innata consentono un tentativo di reinterpretare il proposto ruolo non apoptotico di caspasi-8, FADD e FLIP in queste vie.  Tuttavia, non siamo stati esaustivi.  FADD è stato implicato nella progressione del ciclo cellulare, mentre è stato visto che caspasi-8 promuove la motilità cellulare ed influenza le metastasi tumorali.  E’ possibile che queste funzioni siano indipendenti dal segnale RIPK1-RIPK3, ma semplicemente non sono necessarie per un normale sviluppo e sopravvivenza e perciò non si manifestano in topi con doppio silenziamento.  Tuttavia, esiste l’intrigante possibilità che questi effetti di FADD e caspasi-8 siano dovuti alla modulazione di effetti sconosciuti del segnale RIPK1-RIPK3.  Occorre una rigorosa rivalutazione dei possibili ruoli del segnale RIPK in questi contesti, e fino a quando gli effetti a valle della via RIPK non sono conosciuti, non possiamo essere sicuri del loro coinvolgimento.

Box 1

Il meccanismo di attivazione della caspasi-8

Le caspasi sono presenti in forma inattiva in molti tipi cellulari.  Le caspasi vengono sintetizzate come proenzimi composti da una grande subunità centrale (circa 20 kilodaltons) ed una piccola subunità C-terminale (circa 10 kilodaltons); oltre a questi domini, le caspasi iniziatrici (come caspasi-8, 2 e 9, gli enzimi che danno inizio al segnale apoptotico) posseggono anche un prodominio N-terminale che media le interazioni proteina-proteina.  I proenzimi delle caspasi iniziatrici rimangono monomerici fino a che non sono reclutati da grandi piattaforme di attivazione attraverso le interazioni con i loro prodomini.  Queste piattaforme di grande peso molecolare includono i complessi associati a DR e RIPK1 descritti qui per la caspasi-8, ed il complesso citocromo c/APAF-1 chiamato “apoptosoma” per la caspasi-9.  Una volta reclutati in queste piattaforme, i proenzimi caspasici sono indotti a dimerizzare, e questa dimerizzazione porta all’attivazione enzimatica.  Nel caso della caspasi-8, questa dimerizzazione è seguita da eventi di taglio tra i domini, prima tra le subunità grande e piccola e successivamente tra la subunità grande ed il prodominio.  Questi eventi di taglio stabilizzano l’omodimero di caspasi-8 e rimuovono il prodominio, portando alla formazione di un enzima completamente attivo composto da due subunità grandi e due piccole.  E’ importante per il tema attuale, che una mutazione puntiforme che previene il taglio di stabilizzazione della caspasi-8 tra le subunità grande e piccola previene l’attivazione della caspasi-8 da omodimerizzazione guidata dal prodominio.  Tuttavia, questo mutante non tagliabile è ancora capace di attivarsi attraverso eterodimerizzazione con la proteina FLIP, simile alla caspasi-8.  Questo eterodimero caspasi-8-FLIP è implicato nell’attuazione della soppressione del segnale RIPK3 che definisce il ruolo non apoptotico della caspasi-8.  Tuttavia, come questa soppressione si sviluppa, e come la formazione del complesso caspasi-8-FLIP viene evitata per indurre l’apoptosi rimane non chiarito.  La formazione artificiale degli eterodimeri caspasi-8-FLIP indipendenti dal legame di DR, usando un sistema inducibile di dimerizzazione, innesca velocemente l’apoptosi, indicando che le differenze catalitiche tra omo- ed eterodimero non sono sufficienti a spiegare le loro diverse funzioni.  E’ probabile che il segnale mediato dal recettore eserciti dei controlli aggiuntivi  sul complesso caspasi-8-FLIP, come la localizzazione ristretta o la rapida degradazione, che limita ulteriormente il conseguente taglio di substrati apoptotici.

Box 2

Attivazione dell’NF-kB da parte del recettore per il TNF

Quando il TNF si lega al proprio recettore trimerico, induce un cambiamento conformazionale che determina il reclutamento alla coda citoplasmatica contenente un DD del TNFR1 di RIPK1 e di TNF receptor associated protein with a death domain (TRADD).  Successivamente queste proteine reclutano i membri della famiglia TNFR-associated factor (TRAF), così come cellular inhibitor of apoptosis (cIAP)-1 e -2.  I cIAP sono delle ligasi E3 dell’ubiquitina che catalizzano l’aggiunta di porzioni di ubiquitina attraverso i legami non degradabili di K (lisina)63  a RIPK1 e TRAF-2, così come agli stessi IAP; queste modificazioni a loro volta consentono il reclutamento del complesso di assemblaggio della catena lineare di ubiquitina (LUBAC), che catalizza l’aggiunta di catene lineari di ubiquitina a molteplici membri del complesso, un evento che si pensa stabilizzi queste interazioni e consente un segnale efficiente e sostenuto.  L’NF-kB essential modulator (NEMO), il componente centrale del complesso della chinasi IkB (IKK), è tra i bersagli per l’ubiquitinazione di LUBAC; questa modificazione recluta stabilmente NEMO ed il complesso IKK.  Il complesso IKK è quindi fosforilato e attivato dalle chinasi TAB2 e TAK1, che si associano al legame dell’ubiquitina legata a RIPK1.  L’attivazione del complesso IKK porta alla fosforilazione ed alla degradazione proteasomica della molecola inibitoria IkB, che a sua volta consente l’attivazione e la traslocazione nucleare dei complessi del fattore di trascrizione NF-kB, e all’aumento della trascrizione dei bersagli dell’NF-kB, incluso FLIP.  In seguito a questi eventi, le catene di ubiquitina sono rimossi dal legame con RIPK1 dalla deubiquitinasi CYLD, e ciò consente a RIPK1 di traslocare nel citosol per formare un secondo complesso; si pensa che questo complesso sia il sito dell’interazione funzionale tra RIPK1, RIPK3, FADD, FLIP, e caspasi-8 (descritto in fig. 2).

Box 3

Il ruolo dell’ubiquitinazione

Nel considerare le dinamiche dell’attivazione recettoriale, dell’apoptosi, e della necrosi programmata, è utile notare il ruolo centrale dell’ubiquitinazione in questi processi.  Sia l’ubiquitinazione degradativa che quella non degradativa giocano un ruolo centrale nel controllo dell’attivazione di NF-kB, così come di caspasi-8 e del segnale di RIPK1.  Le catene di ubiquitina possono essere legate attraverso molti residui diversi di lisina nel monomero di ubiquitina, e recenti lavori mostrano che RIPK1 è il bersaglio di 4 tipi separati di legami dell’ubiquitina durante il segnale recettoriale.  La deubiquitinasi CYLD è necessaria per rimuovere le catene di ubiquitina da RIPK1, consentendo la formazione del complesso II, e caspasi-8 può bloccare la necrosi programmata prevenendo questo processo.  Lavori più recenti indicano che l’ubiquitinazione degradativa da cIAP e XIAP previene la formazione indipendente dal recettore di un complesso che contiene RIPK1, chiamato il “ripoptosoma”, che è in grado di innescare l’apoptosi mediata da caspasi-8 così come la necrosi dipendente da RIPK3.  Inoltre, nel contesto della soppressione dell’infiammazione mediata da RIPK1 nel complesso RIG-I tramite caspasi-8, è stato riportato che l’ubiquitinazione a livello di K63 di RIPK1 è necessaria per rendere RIPK1 suscettibile al taglio mediato dalla caspasi-8, meccanismo attraverso cui il segnale RIPK1 è soppresso in questo contesto.  E’ stato anche riportato che caspasi-8 è modificato da catene di ubiquitinazione non degradativa, ed è intrigante che questa modificazione consenta l’attivazione di caspasi-8 non tagliabile, un mutante capace di sopprimere il segnale di RIPK ma non di innescare l’apoptosi.  E’ perciò possibile che l’ubiquitinazione dinamica sia almeno parzialmente responsabile del controllo dell’attivazione di caspasi-8 da parte di FLIP (vedi il Box 1).  E’ stata anche riportata l’ubiquitinazione degradativa del complesso caspasi-8-FLIP, e la rapida degradazione proteasomica di questo complesso potrebbe spiegare come ne viene impedita la stimolazione dell’apoptosi.  Lo studio di queste ed altre modificazioni post-traslazionali nelle dinamiche dell’attivazione dell’NF-kB, dell’apoptosi e della necrosi programmata sarà cruciale per comprendere questi processi intercorrelati.

(Tratto da Andrew Oberst e Douglas R. Green “It cuts both ways: reconciling the dual roles of caspase-8 in cell Death and survival”, Nat Rev Mol Cell Biol; 12:757-763, 2013)

Israele

Posted in Viaggi with tags , , , , on August 21, 2013 by Domenico Delfino

Gli eredi dell’Arca

“…Il secondo errore è credere che la fauna della Bibbia sia scomparsa nel passato remoto.  Se le ultime citazioni di leoni sono precedenti alle Crociate, gli ippopotami del Lago di Tiberiade si sono estinti poco dopo, l’ultimo orso delle montagne al confine con la Siria è stato avvistato nel 1918.  Fino agli stessi anni, in alcuni fiumi che scendono al Mediterraneo, è sopravvissuto il coccodrillo.  Tra i grandi erbivori citati dalla Bibbia, l’unico a salvarsi dall’estinzione è stato lo stambecco (Capra ibex nubiana), una specie più magra e più agile di quella alpina diffusa anche in Egitto e in Sudan, e che oggi è facile osservare nel Parco nazionale di En Gedi, sul Mar Morto, e nel cratere di Ramon nel Deserto del Negev.  Qualche leopardo è sopravvissuto negli angoli più solitari del deserto e quella grande opportunista che è la iena vive ancora in Cisgiordania.  Chi scrive, qualche anno fa, ne ha vista una allontanarsi con la sua andatura ondeggiante dal monastero bizantino di Mar Saba, a solo un’ora d’automobile da Gerusalemme….”

"Avevano l'aspetto del leone ed erano agili come il capriolo nei monti" primo libro delle Cronache

“Avevano l’aspetto del leone ed erano agili come il capriolo nei monti” primo libro delle Cronache

(Tratto da Testo di Stefano Ardito, disegni di Gabriele Maschietti “Animali – Gli eredi dell’Arca” da Meridiani Israele, Anno XXI, N. 167, aprile 2008, Editoriale Domus)

Viaggio in Calabria

Posted in Calabria, libri with tags , , , , on August 20, 2013 by Domenico Delfino

Scilla

“…Devo rendere giustizia alle milizie urbane di S.M. il re Ferdinando: fu portandosi la mano al loro cappello tricorno e chiamandomi eccellenza che mi chiesero il passaporto che sapevano bene ch’io non avevo.  Diedi loro la stessa risposta che avevo dato all’ospite e come se non se l’aspettassero, le suddette milizie mi guardarono con un’aria che voleva dire: Diavolo! Diavolo! Ecco un brutto affare che si prepara.  Ciò fatto, il brigadiere si girò dalla mia parte e sempre col cappello nelle mani fece presente alla Mia Eccellenza ch’era obbligato a condurla dal giudice.

Siccome non avevo nessun dubbio che tutte quelle gentilezze si sarebbero concluse con tale stupida proposta e poiché non mi preoccupavo di attraversare tutta la città con quattro gendarmi, feci cenno al brigadiere che avevo una confidenza da fargli a voce bassa; mi si avvicinò e senza alzarmi dalla sedia gli dissi:

- Fate uscire i vostri soldati.

Il brigadiere guardò intorno a lui, s’assicurò che non ci fosse nessun’arma alla mia portata e girandosi verso i suoi accoliti fece segno di lasciarci soli.  I tre gendarmi ubbidirono subito ed io mi trovai solo con il mio uomo.

- Sedetevi là, dissi al brigadiere mostrandogli una sedia di fronte a me.  Si sedette.

- Adesso, dissi, poggiando i gomiti sul tavolo e mettendo la testa tra le mani, adesso che siamo soli, gli dissi, ascoltatemi.

- Ascolto – disse il mio calabrese.

- Ascoltate signor maresciallo d’alloggio, perché certamente siete maresciallo d’alloggio, non è vero?

- Dovrei esserlo Eccellenza, ma le ingiustizie…

- Lo sarete certamente; lasciatemi quindi darvi un titolo che un giorno o l’altro sarà vostro e che meritate da tutti i punti di vista.  Signor maresciallo d’alloggio, gli dissi, siccome la cosa non può compromettervi, non vi farebbe piacere un sigaro avana, una bottiglia di moscato calabrese ed una piccola somma di due piastre?

Ciò detto, tirai fuori dal mio taschino due scudi e li feci brillare davanti agli occhi del mio interlocutore che con gesto istintivo allungò la mano….”

(Tratto da Alexandre Dumas “Viaggio in Calabria”, traduzione di Antonio Coltellaro, Rubettino Editore, 1996)

Anime nere

Posted in Calabria, libri with tags , , , , on August 19, 2013 by Domenico Delfino

“…La casa era una bassa costruzione in pietre, ricoperta con piccole tegole romane.  Si apriva in un unico ambiente nel quale si cucinava, si mangiava e si dormiva.  L’altezza non superava il metro e sessanta, e qualche secolo prima avrebbe potuto contenere persone in stato eretto, o quasi, posto che ancora adesso i pastori erano legni storti.  L’unico ambiente aveva in un angolo il focolare, lo spazio di terra era delimitato da due pali forcati infissi nel terreno sopra i quali si sistemava il pentolone, caccamo, del latte.  Sul pavimento di terra viva si poggiava una lettiera di ginestra, alle travi di sostegno si appendevano mestoli, rompilatte, asse forato, cestelli di giunco e tutti gli attrezzi del pastore.  La casa era circondata da uno steccato perché non vi entrassero le bestie…”

(Tratto da Gioacchino Criaco “Anime Nere”, Romanzo, Rubettino Ed., 2008)

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