Principi di Tossicologia

La tossicologia è definita come lo studio degli effetti avversi delle sostanze chimiche sugli organismi viventi.  Le sue origini possono essere rintracciate al tempo in cui i nostri antenati preistorici per primi hanno tentato di introdurre nelle loro diete sostanze che non avevano ancora incontrato nel loro ambiente.  Osservando quali sostanze potevano soddisfare la fame senza produrre malattie o morte, gli uomini antichi hanno sviluppato abitudini che miglioravano la sopravvivenza e la proliferazione della specie nel loro ambiente tradizionale ed gli permettevano di adattarsi a nuovi ambienti.  Nel proprio contesto moderno, la tossicologia si disegna pesantemente sulle conoscenze nei campi della chimica e biologia e cerca una comprensione dettagliata degli effetti tossici e dei mezzi per prevenire o ridurre la tossicità.  In molti casi, le scoperte originarie di tossine che hanno causato malattie umane devastanti e sofferenza hanno portato allo sviluppo  di tossine come prova di funzione biologica che oggi viene usata per studiare i meccanismi di base e per lo sviluppo di cure per malattie umane quali l’emorragia post-partum, la psicosi, ed il cancro.

                Una breve storia degli usi documentati degli agenti tossici serve ad illustrare l’importanza di queste sostanze fin dalle culture antiche.  Il papiro di Ebers all’incirca intorno al 1500 prima di Cristo, uno dei documenti medici più antichi giunti a noi, descrive gli usi di molti veleni come la cicuta, oppio, piombo, e rame.  Nel 339 AC, la morte da cicuta era un mezzo ben noto di punizione capitale in Grecia, per esempio per il suicidio forzato di Socrate.  A quel tempo, Ippocrate disquisiva della biodisponibilità e overdose degli agenti tossici, intendendo che l’avvelenamento – usati soprattutto dalle donne aristocratiche come mezzo per liberarsi di un marito non voluto – era di uso comune a Roma.  Intorno al 350 AC, Teofrasto, uno studente di Aristotele, fece molti riferimenti a piante velenose nella sua prima De Historia Plantarum.

                All’incirca intorno al 75 AC, il re Mitridate VI del Ponto (nella Turchia attuale) era ossessionato dai veleni e, fin dalla giovane età, prendeva piccole quantità di almeno 50 veleni nella speranza di sviluppare resistenza ad ognuno di essi.  Questa pratica sembra che avesse indotto una considerevole resistenza ai veleni, dal momento che, a sentire la legenda, per evitare la cattura dai nemici, una mistura classica di veleni non fu efficace in un tentativo di suicidio del re vinto che invece si dovette uccidere con la propria spada.  Il termine “mitridatico” si riferisce ad una mistura antidotale o protettiva di dosi basse ma significative di tossine e possiede ferme basi scientifiche.  Comunque, la pretesa che dosi estremamente basse di agenti tossici possano produrre anche effetti protettivi, concetto di base dell’omeopatia, non ha nessun supporto scientifico.

Nell’82 AC, la Lex Cornelia (legge di Cornelio) fu la prima legge ad essere promulgata a Roma ad includere provvedimenti contro gli avvelenamenti umani.  Approssimativamente nel 60 AC, Dioscoride, un medico dell’esercito romano degli Imperatori Nero, Caligola e Claudio, scrisse un trattato di 6-8 volumi che classificava i veleni in base alla propria origine (vegetale, animale, minerale) ed attività biologica, evitando la comune pratica di classificazione basata su bizzarre teorie d’azione che erano considerate importanti a quel tempo, come la teoria degli umori, che proponeva che la funzione dell’organismo fosse regolata dal giusto equilibrio di fluidi chiamati bile nera, bile gialla, flegma, e sangue.  Questo trattato spesso suggeriva terapie efficaci per gli avvelenamenti come l’uso di emetici, ed è stata la sorgente di base di queste informazioni per i seguenti 1500 anni.

Paracelso (1493-1541) è considerato il fondatore della tossicologia come scienza oggettiva.  Paracelso, che ha cambiato nome da Phillip von Hohenheim, era un pensatore energico, irascibile ed iconoclasta (figura 1.1).  Aveva studiato come medico in Svizzera ed viaggiato abbondantemente in Europa e nel Medio Oriente per imparare l’Alchimia e la Medicina in altre tradizioni del tempo.  Nonostante che l’astrologia rimanesse una parte importante della filosofia, egli evitò la magia nella sua pratica medica.  L’ introduzione della sua pratica di mantenere pulite le ferite e permettere alle stesse il drenaggio per consentire la guarigione gli fece guadagnare un unanime consenso in Europa.  Soprattutto per la tossicologia, Paracelso fu la prima persona ad attribuire gli effetti avversi di alcune sostanze alle sostanze in sé e non alla loro associazione con spiriti maligni o adirati o con Dio.  Paracelso è accreditato di aver ideato il concetto di base della tossicologia, che spesso viene riportato nel modo seguente

Tutte le sostanze sono veleni; non c’è nessuna che non sia un veleno.  La giusta dose differenzia il veleno dal rimedio.

Nonostante che questi ed altri concetti sviluppati da Paracelso fossero, per quei tempi, di rottura e di grande avanzamento nelle conoscenze sulle malattie, essi lo hanno messo in disaccordo con i più importanti praticanti della medicina.  Come conseguenza, fu costretto ad abbandonare la sua pratica medica casalinga ed a passare molti dei suoi ultimi anni viaggiando.  E’ morto a 48 anni, e c’è il sospetto che i suoi nemici lo abbiano preso ed abbiano posto fine alla sua vita così fruttuosa.  Come sarebbe ironico se il padre della tossicologia fosse stato avvelenato!

fig.1.1

E’ utile valutare il significato dell’assioma di Paracelso nella nostra vita di ogni giorno considerando esempi di sostanze note con bassa o elevata tossicità.  L’acqua può essere considerata una delle sostanze meno tossiche tra quelle di uso comune.  Può l’acqua essere tossica? In effetti ci sono molti lavori sulla sua tossicità in letteratura.  Per esempio, nel 2002 uno studente della “California State University” a Chico è stato sottoposto ad una prova di iniziazione di una confraternita in cui gli è stato chiesto di bere fino a cinque galloni di acqua mentre veniva spruzzato con acqua ghiacciata.  Il consumo di quella quantità d’acqua in un tempo breve ha determinato la diluizione degli elettroliti nel proprio sangue fino al punto che le sue normali funzioni neurologiche sono andate perse ed il giovane è tragicamente morto.

Consideriamo adesso il concetto opposto e cioè che l’esposizione ad una piccola quantità di un agente altamente tossico possa non avere conseguenze.  Per esempio, il batterio che produce il botulismo, il Clostridium Botulinum, può produrre quantità letali di tossina botulinica in prodotti inscatolati impropriamente sterilizzati.  Questa tossina batterica è una delle sostanze note per essere più tossiche.  La stessa tossina, però, è usata terapeuticamente, per esempio, per trattare il colon spastico o come cosmetico per ridurre le rughe cutanee.

BRANCHE DELLA TOSSICOLOGIA

                La scienza della tossicologia è prosperata fin dalle sue prime origini nel mito e nella superstizione, ed è divenuta sempre più importante per molti aspetti della vita moderna.  La moderna tossicologia impiega conoscenze avanzate in chimica, fisiologia, biochimica e biologia molecolare, spesso aiutate da tecnologie informatiche, per affrontare problemi di agenti tossici in molti campi di specializzazione.

Le più importanti specializzazioni tradizionali della tossicologia affrontano molte necessità specifiche della società.  Ciascuna specializzazione ha le proprie caratteristiche assolutamente uniche, e lavorare in alcune aree può richiedere una certificazione professionale.  La tossicologia clinica si occupa della prevenzione, diagnosi e gestione dell’intossicazione, di solito all’interno di un ospedale o in un ambiente clinico.  La tossicologia forense è l’applicazione di tecniche note di analisi su campioni biologici per documentare la presenza di farmaci ed altre sostanze potenzialmente tossiche, e di solito viene praticata in collaborazione con le forze dell’ordine.  La tossicologia occupazionale cerca di identificare gli agenti pericolosi nel posto di lavoro, definisce le condizioni per il loro uso sicuro, e previene l’assorbimento di quantità dannose.  La tossicologia ambientale si occupa dell’impatto potenzialmente deleterio di sostanze chimiche ambientali naturali o prodotte dall’uomo sugli organismi viventi, sia negli ambienti naturali che per l’uomo.

La tossicologia regolatoria concerne la raccolta, l’elaborazione, e la valutazione di dati tossicologici di tipo epidemiologico e sperimentale per consentire decisioni basate su dati scientifici dirette alla protezione delle persone contro gli effetti dannosi delle sostanze chimiche.  Inoltre, questa area della tossicologia supporta lo sviluppo di protocolli standard e di nuovi metodi per migliorare continuamente le basi scientifiche dei processi di decisione.  L’ecotossicologia  ha a che fare con la distribuzione ambientale e gli effetti tossici di agenti fisici e chimici su popolazioni e comunità di organismi viventi all’interno di un ecosistema definito.  Mentre la tossicologia ambientale tradizionale ha a che fare con gli effetti tossici su organismi individuali, l’ecotossicologia si occupa dell’impatto su popolazioni di organismi viventi e su ecosistemi.

La tossicologia alimentare si focalizza sull’analisi e gli effetti tossici di sostanze bioattive che sono presenti nel cibo.  La tossicologia alimentare rappresenta un campo distinto che valuta gli effetti di componenti della matrice chimica complessa della dieta sulle attività di agenti tossici che possono essere prodotti endogeni naturali o possono essere introdotti da organismi contaminanti, o durante la produzione, l’elaborazione e la preparazione dei cibi.

DOSE-RISPOSTA

                Dal momento che per ciascuna sostanza esistono sia dosi tossiche che non tossiche, ci si può anche domandare cosa fanno dosi intermedie.  Infatti, l’intensità della risposta biologica è proporzionale alla concentrazione della sostanza nei liquidi corporei dell’organismo esposto.  La concentrazione della sostanza nei fluidi corporei, a sua volta, è di solito proporzionale alla dose della sostanza a cui l’organismo è soggetto.  Appena la dose della sostanza aumenta, la gravità della risposta tossica aumenterà fino a che una dose sufficientemente alta non diverrà letale.  La cosidetta dose-risposta individuale può essere rappresentata come un diagramma del grado di gravità di qualsiasi risposta quantificabile, come un’attività enzimatica, la pressione sanguigna, o la frequenza respiratoria, in funzione della dose.  Il risultante diagramma della risposta contro il log10 della concentrazione fornisce una curva sigmoidale (figura 1.2) che sarà quasi lineare all’interno di un intervallo di concentrazioni medie e sarà asintotica ai livelli di risposta zero e risposta massima.  Questo comportamento della risposta è chiamato dose-risposta graduata dal momento che la gravità della risposta aumenta sopra un intervallo di concentrazioni della sostanza in studio.

fig1.2

                Le valutazioni della tossicità con singoli organismi in studio in ogni caso, non sono usate spesso perché gli organismi singoli, perfino le specie di roditori geneticamente omogenei usati in laboratorio, possono variare da uno all’altro nella loro sensibilità agli agenti tossici.  Infatti, negli studi di gruppi di organismi, con l’aumento della dose, non c’è ne è una in cui tutti gli organismi del gruppo sviluppano improvvisamente la stessa risposta.  Ci sarà invece un intervallo di dosi in cui gli organismi risponderanno allo stesso modo alla sostanza in studio.  Al contrario della dose-risposta graduata individuale, questo tipo di valutazione della tossicità dipende dall’eventuale sviluppo da parte dei soggetti in studio di una risposta specifica oppure no, ed è chiamata una risposta tutto o nulla o della popolazione quantale.  Per specificare questo comportamento di gruppo, viene prodotto un diagramma della percentuale degli individui che rispondono in maniera specifica contro il log della dose.

                Consideriamo, per esempio, la produzione di una curva dose-risposta per un ipotetico agente ipertensivo.  La sostanza in studio verrebbe somministrata a dosi crescenti a gruppi di 10 soggetti o organismi in studio.  Viene quindi determinata la percentuale di individui in ciascun gruppo che rispondono in una maniera specifica alla sostanza (per es., con una pressione sanguigna di 140/100).  I dati sono quindi diagrammati come percentuale di risposta in ciascun gruppo verso il log della dose data a ciascun gruppo.  In un intervallo di dosi basse, non ci saranno soggetti in studio che sviluppano la pressione sanguigna specificata.  All’aumentare delle dosi, aumenteranno le percentuali  di individui dei gruppi che sviluppano la pressione sanguigna richiesta, fino a che non si raggiunge una dose in cui il massimo numero di individui del gruppo rispondono con la pressione sanguigna specifica.  Questa dose, determinata statisticamente, è la dose media per dedurre una risposta definita nella popolazione.  Se la dose aumenta ulteriormente, la percentuale di individui che rispondono con la pressione sanguigna specifica diminuirà, dal momento che gli individui che hanno risposto alle dosi più basse adesso mostrano pressioni sanguigne in eccesso rispetto al livello specificato.  Eventualmente, si raggiungerà una dose in cui tutti i soggetti in studio sviluppano pressioni arteriose eccessive rispetto al livello specificato.

Quando la risposta è specificata in maniera appropriata, si possono rappresentare in diversi modi informazioni da esperimenti di dose-risposta quantale.  Si può costruire un diagramma di frequenza-risposta (figura 1.3) diagrammando la percentuale di individui che rispondono in ciascun gruppo in funzione della dose.

fig1.3

La curva che si genera con questi dati ha la forma di una normale distribuzione Gaussiana e, perciò, i dati sono soggetti alle leggi statistiche per questo tipo di distribuzione.  In questo modello, i numeri di individui su entrambi i lati dalla media sono uguali e l’area sotto la curva rappresenta la popolazione totale.  L’area sotto la curva legata ai punti di flessione include il numero di individui che rispondono alla dose media, più o meno una deviazione standard (SD) dalla dose media, o il 95,5% della popolazione.  Questo valore medio è utile per specificare l’intervallo di dosi in cui la maggior parte degli individui rispondono nello stesso modo.

Le curve di frequenza-risposta possono essere generate da qualsiasi gruppo di dati tossicologici in cui una risposta quantificabile viene misurata semplicemente registrando la percentuale di soggetti che rispondono a ciascuna dose meno la percentuale che risponde a dosi più basse.  Generalmente, la curva frequenza-risposta ottenuta con un esperimento si avvicina soltanto alla forma di una vera distribuzione normale.  Queste curve illustrano chiaramente, comunque, che c’è una dose media in cui risponderà in un modo specifico la maggiore percentuale di individui.  Ci saranno sempre individui che richiedono o dosi più elevate (iporesponsivi) o più basse (iperresponsivi) della media per sviluppare la stessa risposta.

Nonostante che le curve di distribuzione frequenza-risposta siano spesso usate per certi tipi di analisi statistiche dei dati di dose-risposta, viene usata più comunenemente la presentazione dei dati cumulativi di risposta, soprattutto per rappresentare i dati di risposta letale.  La curva cumulativa-risposta può essere generata per dati di frequenza-risposta non letale graficando il log della dose contro la percentuale di individui che rispondono con almeno una risposta specifica.  Come è illustrato in figura 1.3, se le risposte della pressione sanguigna usate nell’esempio precedente sono graficate come percentuale di individui in ciascun gruppo di dosi che rispondono con un valore di almeno 140/100, la curva che ne risulta sarà sigmoidale.  Molti valori importanti utilizzati per caratterizzare la tossicità si ottengono da questo tipo di curva.  Il NOAEL (livello di effetti avversi non osservati) è la dose più alta in cui nessuno degli effetti tossici specificati è stato osservato.  Il LOAEL (livello più basso di effetti avversi osservati) è la dose più bassa in cui compare tossicità.  La TD50 è la dose statisticamente determinata che produce tossicità nel 50% degli organismi studiati.  Quando la risposta tossica di interesse è la letalità, la notazione appropriata è la LD50.  Ad una dose sufficientemente elevata, il 100% degli individui risponderanno nel modo specificato.  Dal momento che i valori di LD e TD sono determinati statisticamente e sono basati sui risultati di molteplici esperimenti con molti organismi in studio, i valori dovrebbero essere accompagnati da qualche mezzo per valutare la variabilità del valore stesso.  L’intervallo di probabilità (o valore p), che è comunemente usato, in genere si accetta che sia meno di 0.05.  Questo valore indica che lo stesso valore di LD o TD dovrebbe essere ottenuto in 95 di 100 ipotetiche ripetizioni dello stesso esperimento.

Le curve risposta-cumulativa possono facilitare i paragoni delle potenze tossiche tra i componenti o tra diverse popolazioni in studio.  Per esempio, per due sostanze con curve risposta-cumulativa che non si sovrappongono, la sostanza con la curva che copre l’intervallo di dosi più basse è chiaramente la più tossica delle due.  Se il trattamento precedente con la sostanza A di una popolazione studio risulta in uno slittamento della curva dose-risposta verso destra per la tossina B, allora la sostanza A esercita un effetto protettivo contro la sostanza B.  Nel caso incui le curve dose-risposta per più tossine si sovrappongono, i paragono diventano un po’ più complessi.  Ciò può avvenire quando l’inclinazione delle curve dose-risposta non è la stessa, come mostrato in figura 1.5.  Questi ipotetici composti  hanno la stessa LD80, e si dice che abbiano la stessa tossicità a quella dose.  Al di sotto di quella dose, però, il composto A produce la percentuale più alta di tossicità rispetto al composto B e, quindi,  il composto A è più tossico.  A dosi superiori alla LD80, il composto B produce la più alta percentuale di letalità e, quindi, è la sostanza più tossica.  Se ci si basa solo sui valori di LD50, il composto A è più tossico del composto B.  Quindi, nel paragonare le tossicità di due sostanze, la risposta tossica deve essere specificata, deve essere esplicitato l’intervallo di dosi di tossicità, e se le tossicità sono simili, l’inclinazione della porzione lineare delle curve dose-risposta deve essere indicata.

POTENZA

                Nonostante che tutte le sostanze esibiscano un comportamento di dose-risposta tossico e letale, c’è un ampio intervallo di valori di LD50 per le sostanze tossiche.  Per convenzione, le potenze tossiche cadono all’interno di molte categorie.  In tabella 1.1 è presente una lista di valori di LD50 per molte sostanze abbastanza comuni, insieme con una classificazione delle tossicità da quelle estreme a quelle quasi assenti.

tab1.1

Sostanze con valori di LD50 maggiori di circa 2 g/kg di peso corporeo sono generalmente considerate di bassa tossicità, cioè che una quantità relativamente grande, nella dimensione di almeno una tazza, è richiesta per produrre l’effetto letale in un uomo adulto e sono facilmente evitabili in molte circostanze.  Mentre, l’esposizione a sostanze nella categoria estrema con LD50 < 1 mg/kg richiede solo poche gocce o anche meno per essere letale e deve essere considerata pericolosa.

ORMESI

L’ormesi è un fenomeno di dose-risposta caratterizzato da un effetto benefico a bassa dose e da un effetto tossico a dose elevata, che risulta in una curva dose-risposta o a forma di J o di U invertita.  Una sostanza ormetica, quindi, invece di non avere alcun effetto a basse dosi, come nel caso di molte tossine, produce un effetto positivo rispetto ai soggetti non trattati.  Una curva dose-risposta rappresentativa di questo fenomeno è presentata in figura 1.4.

fig1.4

Le sostanze richieste per una normale funzione fisiologica e sopravvivenza mostrano un comportamento ormetico di dose-risposta.  A dosi molto basse, c’è un effetto avverso (deficienza), e con l’aumentare della dose si produce un effetto benefico (omeostasi).  A dosi molto elevate, compare una risposta avversa da tossicità.  Per esempio, dosi elevate di vitamina A possono causare tossicità epatica e difetti alla nascita mentre la deficienza di vitamina A contribuisce alla cecità ed aumenta il rischio di malattia e morte per infezioni severe.  Sostanze non nutritive possono anche avere effetti stimolatori o benefici a basse dosi ma producono tossicità a dosi elevate.  Così, il consumo alcolico cronico a dosi elevate causa cancro esofageo ed epatico, mentre a basse dosi può ridurre la malattia cardiaca coronarica.  Un altro esempio è costituito dalle radiazioni, che a bassi livelli inducono risposte adattative benefiche e ad alti livelli causano distruzione tissutale e cancro.

MARGINI DI SICUREZZA

La sicurezza è definita come la libertà dal pericolo,  lesione o danno.  La sicurezza assoluta di una sostanza non può essere provata dal momento che la prova di sicurezza si basa su l’evidenza negativa, o la mancanza di male o danno causate dalla sostanza.  Un gran numero di esperimenti possono essere fatti per dimostrare che una sostanza non causa effetti avversi, ma questi esperimenti non proveranno mai la sicurezza della sostanza.  C’è sempre la possibilità che l’esperimento successivo possa dimostrare che la sostanza produca un effetto avverso in protocolli di studio classici o nuovi.  Inoltre, il nostro concetto di sicurezza continua ad evolvere, e noi adesso siamo coscienti che anche piccoli cambiamenti, per esempio, nell’attività di un enzima importante, potrebbero preannunciare un effetto altamente negativo nel futuro.  Infatti, il nostro concetto di sicurezza a riguardo dell’esposizione tossica continua a svilupparsi con la crescita delle nostre conoscenze degli effetti biochimici e molecolari delle tossine, e con la nostra capacità di misurarle.

                Dal momento che la sicurezza assoluta non può essere provata, bisogna valutare la sicurezza relativa, che richiede il paragone degli effetti tossici tra sostanze diverse o della stessa sostanza in condizioni diverse.  Quando le condizioni sperimentali per studiare la tossicità in una specie sono state definite attentamente, e l’inclinazione della curva dose-risposta è quasi la stessa, le tossicità di due sostanze possono spesso essere calcolate semplicemente determinando il rapporto tra TD50S e LD50S.  Spesso, comunque, un concetto più utile è il paragone di dosi di una sostanza che esprimono gli effetti desiderati ed indesiderati.  Il margine di sicurezza di una sostanza è l’intervallo di dosi tra gli effetti benefici e tossici; Per valutare le possibili differenze nelle inclinazioni delle curve dose-risposta efficace e tossica, il calcolo è il seguente:

Margine di sicurezza (MS) = LD1/ED99

LD1 è l’1% della dose letale ed ED99 è il 99% della dose efficace.  Una misura meno desiderabile della sicurezza relativa di una sostanza è l’indice terapeutico, che è definito nel seguente modo:

Indice Terapeutico (TI) = LD50/ED50

                TI può fornire una indicazione fuorviante del grado di sicurezza di una sostanza in quanto questo calcolo non prende in considerazione le differenze di inclinazione delle curve di risposta della LD ed ED.  Nonostante ciò, questo metodo è stato tradizionalmente usato per stimare la sicurezza relativa.  I dati di dose-risposta presentati in figura 1.5 servono ad illustrare come l’uso del TI può dare paragoni fuorvianti della tossicità relativa delle sostanze.

                In questo esempio, il farmaco A ed il farmaco B hanno la stessa LD50 = 100 mg/kg ed ED50 = 2 mg/kg.  Il paragone delle tossicità, quindi, fornisce lo stesso TI = 100/2 = 50.  L’indice terapeutico non prende in considerazione l’inclinazione delle curve dose-risposta.  Il margine di sicurezza, comunque, può superare questa mancanza tramite l’uso dell’ED99 per l’effetto desiderato e dell’LD1 per quello indesiderato.  Così,

MS = LD1/ED99 = 10/10 = 1 per

Il farmaco A, e per il farmaco B

= 0.002/10 = 0.0002

Perciò, secondo il paragone MS, il farmaco B è molto meno sicuro del farmaco A.

                Per sostanze senza una rilevante risposta biologica benefica, i concetti di MS e TI hanno un significato minore.  Molte sostanze diverse come contaminanti ambientali e additivi alimentari cadono in questa categoria.  Per queste sostanze, la sicurezza nell’esposizione viene stimata in base al NOAEL corretto da una serie di fattori di suscettibilità della popolazione per ottenere un valore per l’Assunzione giornaliera accettabile (ADI).  L’ADI è una stima del livello di esposizione giornaliera ad un agente che si prevede non sia con un impatto avverso sulla salute della popolazione umana.  Per pesticidi ed additivi alimentari, è l’assunzione giornaliera della sostanza chimica, che durante il corso dell’intera vita sembra essere senza rischio apprezzabile sulla base delle conoscenze del momento, con l’aggiunta di ulteriori fattori di sicurezza.  L’ADI si calcola nel modo seguente:

ADI = NOAEL/(UF x MF)

Dove UF è il fattore di incertezza ed MF il fattore di modificazione.

                UF ed MF forniscono le correzioni all’ADI che si presume assicurino la sicurezza calcolando l’incertezza in estrapolazione della dose, l’incertezza nell’estrapolazione della durata, la sensibilità differenziale tra uomini ed animali, e la sensibilità differenziale tra uomini (per es., il presunto aumento di sensibilità tra bambini ed adulti).  Il valore dell’errore comune per ciascun fattore di incertezza è 10, ma il grado di sicurezza dovuto ad un  fattore di 10 non è stato quantificato in modo soddisfacente ed è oggetto di continue sperimentazioni e controversie.  Quindi, per una sostanza che innesca tutti e quattro i fattori di incertezza indicati precedentemente, il calcolo sarebbe ADI = NOAEL/10,000.  In alcuni casi, per esempio, se si sa che il metabolismo di una sostanza da una sensibilità maggiore nell’organismo in studio rispetto all’uomo, si può applicare un MF di meno di 1 nel calcolo dell’ADI.

fig1.5

FATTORI BIOLOGICI CHE INFLUENZANO LA TOSSICITA’

E’ chiaro dalla discussione precedente che tutte le sostanze a dosi sufficientemente alte possono esibire tossicità e ci sarà un intervallo di sensibilità per gli effetti tossici tra individui.  Adesso noi considereremo i fattori fisiologici ed anatomici che possono influenzare tale sensibilità.  Lo schema presentato in figura 1.6 riassume i processi biologici che possono modulare le risposte, sia benefiche che avverse, ad una sostanza chimica somministrata.

fig1.6

                L’assorbimento tessutale è generalmente richiesto perché molte sostanze possano esibire i loro effetti tossici.  Tale assorbimento, per esempio, può risultare in una distribuzione limitata della sostanza nel o vicino al punto di contatto, o può anche portare alla penetrazione della sostanza nella circolazione sanguigna o linfatica ed alla distribuzione nell’intero organismo.  Quando una sostanza penetra nei liquidi biologici, può esistere in forma libera o legata, soprattutto alle proteine plasmatiche.  Inoltre, mentre si trova nei liquidi corporei, la sostanza può essere traslocata in forma legata o libera in siti distanti nel corpo.  I siti di deposito sono compartimenti dell’organismo in cui il composto è legato con una affinità sufficientemente elevata da ridurre la propria concentrazione libera nella circolazione generale.  Ossa, tessuto adiposo, e fegato sono siti di deposito comuni per gli xenobiotici.  Il tempo di residenza delle sostanze nei siti di deposito possono essere anche di decadi e dipende dall’affinità di legame per il sito e dalla concentrazione della sostanza nei fluidi circolanti.  Appena la concentrazione della sostanza nei liquidi corporei cala a causa della cessazione alla sua esposizione, la sostanza sarà rilasciata nella circolazione ad un ritmo che dipenderà dall’affinità di legame per un componente del tessuto legato.

I siti di biotrasformazione sono luoghi nelle cellule di alcuni organi che mediano il metabolismo degli xenobiotici.  I tessuti maggiormente attivi per questa biotrasformazione sono le porte di entrata nel fegato e nel piccolo intestino.  Nella maggior parte dei casi, la biotrasformazione converte la sostanza ad una forma ossidata e coniugata che è idrosolubile e più facilmente eliminabile con le urine o con la bile.  In alcuni casi, comunque, metaboliti intermedi nel processo di biotrasformazione sono responsabili degli effetti tossici della sostanza somministrata.

Infine, lo xenobiotico o il suo metabolita attivato incontrerà il proprio sito d’azione e di tossicità.  Il bersaglio molecolare è un componente della via metabolica o di segnale che è importante per la funzione normale o per il normale sviluppo dell’organo.  Nonostante che un agente tossico possa influenzare negativamente le funzioni di molte macromolecole tessutali e delle cellule che le contengono, questi effetti possono non essere importanti per il benessere dell’organo e dell’organismo, e non sono considerati siti centrali dell’azione tossica.  Ciascuno di questi fattori che influenzano la tossicità saranno discussi nelle sezioni seguenti.

ASSORBIMENTO

Perché una sostanza possa raggiungere un sito effettore specifico all’interno di un organello di un organismo complesso, la sostanza deve passare spesso attraverso una serie di membrane.  Nonostante che le membrane in varie cellule dell’organismo – come i cheratinociti cutanei, gli enterociti intestinali, le cellule dell’endotelio vascolare, e le membrane nucleari – abbiano determinate caratteristiche che le distinguono l’una dall’altra, la composizione di base delle varie membrane è molto simile.  Un modello generale di membrana è in figura 1.7.

fig1.7

                In questo modello, la membrana è rappresentata come un doppio strato fosfolipidico con porzioni idrofiliche esterne ed una parte idrofobica interna.  Le proteine si trovano disperse in tutta la membrana con alcune di esse che attraversano l’intero suo spessore e si proiettano al di là della sua superficie.  La membrana cellulare classica è spessa approssimativamente tra 7.5 e 10 nanometri ed è elastica.  E’ composta quasi interamente da fosfolipidi e proteine con piccole quantità di carboidrati sulla superficie.

                Uno sguardo più accurato della struttura chimica della componente fosfolipidica della membrana consente di capire i motivi della sua composizione e le conseguenze sulla sua funzione.  Come si vede in figura 1.8, la testa polare del fosfolipide è composta da una metà fosfato legata ad altre piccole molecole come la colina, serina, etanolammina, ed inositolo che possono aumentare la polarità del fosfolipide o fungono da siti di ulteriore modificazione per il controllo della funzione cellulare, per esempio, attraverso l’aggiunta di un gruppo carboidratico o fosfato.

fig1.8

La composizione della componente lipidica dei fosfolipidi contribuisce alla fluidità della membrana e, quindi, può influenzarne la funzione.  Per esempio, una adeguata fluidità della membrana è, in parte, dovuta all’incorporazione di acidi grassi cis-non saturi.  Il doppio legame in cis diminuisce la forza delle interazioni tra le catene lipidiche adiacenti in paragone ai lipidi saturi o a quelli che contengono doppi legami in trans.  Modificazioni della fluidità può influenzare molte funzioni cellulari, tra cui il trasporto mediato da carriers, le proprietà di alcuni enzimi e recettori di membrana, trasportatori di membrana, citotossicità immunologica e chemioterapeutica, e la crescita cellulare.

Un’altra caratteristica importante delle membrane cellulari è la presenza di canali acquosi o pori.  Nonostante l’acqua possa diffondere passivamente ad un ritmo basso attraverso il doppio strato fosfolipidico continuo della membrana, alcuni tipi cellulari esprimono un ritmo di trasporto dell’acqua molto più elevato di altri a causa della presenza di pori in membrana.  Le proteine transmembrana che formano questi pori comprendono una famiglia di circa 12 membri chiamati o acquaforine, se consentono solo il passaggio di acqua, o acquagliceroforine, se consentono anche il passaggio di glicerolo e di altri piccoli soluti neutri.  La conformazione delle acquaforine più studiate, acquaforina 1 (AQP1) dei globuli rossi del sangue, è indicata in figura 1.9.  Guardando dalla superficie extracellulare, AQP1 forma un tetramero elegante ed altamente simmetrico nel poro.  L’acqua passa attraverso i canali in ciascuna delle molecole AQP1 del poro.  Il ritmo di passaggio di acqua e soluti attraverso questi pori dipende dalle dimensioni del poro stesso, che può essere tessuto-specifico e regolato da ormoni.  Per esempio, i canali in molti tipi cellulari sono meno di 4 nm di diametro e consentono il passaggio di molecole di peso molecolare di solo poche centinaia di Dalton.  Al contrario, i pori dei glomeruli renali sono molto più grandi fino a circa 70 nm, e consentono il passaggio di alcune piccole proteine (< 60,000 Da).

fig1.9

TIPI DI TRASPORTO DI MEMBRANA

I processi di movimento di sostanze attraverso membrane biologiche sono classificati come diffusione passiva e trasporto attivo.  I processi di diffusione passiva, che includono la diffusione semplice e la diffusione facilitata, non richiedono energia in forma di ATP e sono guidati da gradienti di concentrazione.

                La diffusione semplice è caratterizzata dalla diffusione passiva di molecole idrofobiche attraverso le membrane lipidiche o di piccole molecole idrofile che attraversano pori acquosi.  Il ritmo di trasporto degli xenobiotici lipofili attraverso una membrana classica dipende dal peso molecolare, dai legami di idrogeno, e dall’area superficiale polare.  Gli xenobiotici lipofili con peso molecolare maggiore di circa 500 Da tendono a non passare facilmente attraverso la membrana lipidica.  Questo succede anche con molecole che hanno caratteristiche molto elevate di legami ad idrogeno.  In generale, il ritmo di passaggio di xenobiotici lipofili attraverso la membrana è proporzionale al coefficiente di ripartizione octanolo/acqua o LogP.  Infatti, sostanze con un logP relativamente alto come il pesticida DDT ed il contaminante ambientale TCDD (logP di circa 7) sono velocemente assorbite nelle membrane lipidiche.  Al contrario, sostanze con logP relativamente basso come il pesticida paracquat, l’antibiotico cefalosporina, ed altre molecole cariche (logP < -4.5) non sono assorbite in maniera apprezzabile nella membrana lipidica tramite un meccanismo passivo.

                La diffusione facilitata è un trasporto mediato da un trasportatore di sostanze solubili in acqua che mimano la struttura di sostanze endogene che esistono normalmente nel corpo.  Per esempio, il glucosio di solito entra nelle cellule attraverso speciali trasportatori di glucosio che non richiedono ATP.  Alcuni farmaci come il 2-dessossiglucoso e relativi derivati sono stati progettati per entrare nella cellula competendo con il glucosio per l’accesso ai trasportatori di glucosio.  Esistono altri trasportatori passivi per ioni metallici come il sodio, potassio, e calcio, alcuni dei quali possono essere cooptati da metalli tossici come il cadmio ed il piombo. 

                Nonostante entrambi i tipi di diffusione passiva sono guidati da gradienti di concentrazione del substrato, in alcune circostanze questi processi possono risultare in un accumulo differenziale di sostanze in assenza di tali gradienti.  Per esempio, nel caso della diffusione di acidi e basi deboli attraverso una membrana che separa compartimenti con pH diverso.  Dal momento che le molecole ionizzate sono poco assorbite nella membrana lipidica in paragone alle forme neutre, il ritmo di trasporto dipende dal grado di ionizzazione della molecola.  Acidi deboli sono protonati e non ionizzati a basso pH e sono più lipofili che ad un pH elevato.  Similmente, basi deboli sono deprotonate e non ionizzate a pH elevato e sono più lipofile che ad un basso pH.  Il grado di ionizzazione, a sua volta, dipende dal pK della molecola e dal pH del mezzo secondo la reazione di Henderson-Hasselbach:

Per gli acidi: pKa – pH = log[non ionizzato]/[ionizzato]

Per le basi: pKa –pH = log[ionizzato]/[non ionizzato]

                Attraverso queste equazioni, il pH in cui un acido o una base organica deboli sono ionizzate per il 50% è il pKa.  Appena il pH cambia di 2 unità dal livello di pK, il grado di ionizzazione di un acido debole o di una base debole o aumenta al 99% o diminuisce all’1%.  Quindi, per un acido carbossilico debole come l’acido benzoico con pKa = 4.2, nel passaggio dallo stomaco, con un pH di circa 2, al sangue, con un pH di circa 7, il grado di protonazione decresce da circa il 99% all’1%.  Quindi, un acido debole si accumula nel compartimento circolatorio con un pH più elevato.  Con un analogo ragionamento, il ritmo di assorbimento di una base debole come l’anilina, con pKa = 5, è basso a causa del fatto che esiste come acido coniugato meno lipofilo nell’ambiente a pH basso dello stomaco.

                Un ulteriore mezzo attraverso cui le sostanze sono assorbite per diffusione passiva coinvolge la distribuzione differenziale dei siti di legame per la sostanza.  Se ci sono più siti di legame da un lato della membrana rispetto all’altro, il lato della membrana con il più alto livello si siti di legame avrà una quantità più elevata della sostanza, indipendentemente dalla concentrazione uguale della sostanza libera.  Per esempio, una sostanza che viene introdotta nel sangue, che è ricco in siti di legame proteici, non si accumulerà nel fluido di un altro compartimento come il sistema nervoso centrale dove il livello di siti proteici di legame è basso.  Questa distribuzione differenziale di siti di legame per gli xenobiotici contribuisce alla barriera per l’accumulo delle sostanze nel sistema nervoso centrale.

                Nonostante che i processi di trasporto di membrana passivo governino principalmente l’accesso di molte tossine a bersagli critici nelle cellule, anche il trasporto attivo è critico in molti casi importanti.  Al contrario dei processi di trasporto passivo, il trasporto attivo richiede energia da ATP, funziona contro gradiente di concentrazione, ed è saturabile.  In modo non sorprendente, la maggiore parte dei processi attivi per il trasporto di sostanze nelle cellule sono selettivi per nutrienti e sostanze endogene importanti.  In questa lista sono inclusi trasportatori attivi per gli zuccheri, amminoacidi neutri e basici, acidi grassi, vitamina C, vitamina B12, sali biliari, e molti ioni metallici.  Così come per il trasportatore per la diffusione facilitata del glucosio, agenti tossici con struttura simile a nutrienti possono competere con essi per il trasporto attivo nelle cellule.

ASSORBIMENTO DELLE TOSSINE NEL TRATTO ALIMENTARE    

Oltre al peso molecolare ed alle caratteristiche lipofile dello xenobiotico, l’entità dell’assorbimento degli xenobiotici nel tratto alimentare dipende dalle caratteristiche fisiologiche ed anatomiche di ciascun tratto (figura 1.10), dal tempo di permanenza in ciascuna sezione, e dalla presenza di cibo.

fig1.10

                C’è una correlazione ragionevole tra il valore logP di alcuni farmaci alcaloidi conosciuti ed il loro assorbimento dopo somministrazione sublinguale (orale).  Per la cocaina, per esempio, una sostanza con liposolubilità relativamente alta, il rapporto tra dose efficace sublinguale e dose sottocutanea è approssimativamente di 2:1 (per es., è richiesto il doppio della dose orale rispetto a quella iniettiva) per produrre la stessa risposta.  Al contrario, la morfina, sostanza con liposolubilità relativamente bassa, richiede una dose sublinguale che è circa 10 volte più alta della dose sottocutanea per dare un effetto simile.  Questi risultati evidenziano un ruolo preminente del processo di diffusione lipidica nell’assorbimento di questi alcaloidi.

                Il ritmo di assorbimento degli xenobiotici nello stomaco dipende in larga parte dalle proprietà acido-base della sostanza.  Acidi deboli sono più liposolubili nella loro forma non ionizzata nell’ ambiente altamente acido dello stomaco, che, nell’uomo, è di solito in un intervallo di pH tra 1 e 2 e sale fino a 4 durante la digestione.  Dal momento che il pH del sangue è vicino alla neutralità, l’acido debole è deprotonato a base coniugata più polare che determina l’accumulo della sostanza nel sangue.  Al contrario, basi deboli sono in forma di acidi coniugati, protonati nel basso pH del succo gastrico e quindi non sono ben assorbiti.

                Il piccolo intestino è il sito principale di assorbimento degli xenobiotici della dieta.  Dal momento che il pH del contenuto del piccolo intestino varia tra pH 6 e 7 nel tratto prossimale e pH 7 e 8 nell’ileo distale, acidi e basi saranno carichi e relativamente polari.  Secondo l’equazione di Henderson-Hasselbach, comunque, a meno che le sostanze non siano acidi e basi forti, una proporzione significativa dello xenobiotico sarà in forma non ionizzata, meno polare.  Quindi, dal momento che il piccolo intestino è molto lungo ed è tappezzato da enterociti altamente assorbenti, l’assorbimento di acidi e basi deboli in questo tessuto può essere quasi completo anche se l’equilibrio pende pesantemente in favore delle specie cariche.

                Il colon è l’ultima sezione di maggiore assorbimento del tratto alimentare.  Nonostante il pH del contenuto del colon è simile a quello del piccolo intestino distale (per es., pH 7-8),  e le cellule epiteliali coliche esprimono una grande varietà di proteine trasportatrici, l’assorbimento dello xenobiotico nel grande intestino è relativamente minore rispetto al piccolo intestino a causa della considerevole minore lunghezza ed area di superficie del colon.  Comunque, il grande intestino può fungere da sito di assorbimento per certe sostanze, soprattutto quelle prodotte dall’azione batterica nell’intestino più basso, come sarà discusso in seguito.

Oltre alle caratteristiche fisiologiche ed anatomiche del tratto alimentare che influenzano l’assorbimento di xenobiotici, anche l’effetto del cibo può essere significativo.  La maggioranza delle interazioni cibo-farmaco importanti sono causate da cambiamenti indotti dal cibo sulla biodisponibilità del farmaco.  Infatti, l’effetto più frequente del cibo è di ridurre la biodisponibilità di farmaci somministrati oralmente, talvolta fino al punto di bloccare l’attività del farmaco.  Frequentemente queste interazioni sono causate dalla chelazione con componenti presenti nel cibo come nel caso di antibiotici come penicillamina e tetracicline.  Inoltre, la risposta fisiologica all’assunzione di cibo, in particolare la secrezione acida gastrica, può ridurre la biodisponibilità di certi farmaci attraverso la distruzione del farmaco o della capsula in cui viene formulato.  In alcuni casi, comunque, la somministrazione del farmaco con il cibo può determinare un aumento della biodisponibilità sia a causa dell’aumento della solubilità del farmaco indotta dal cibo sia a causa della secrezione acida gastrica o biliare in risposta all’assunzione di cibo.  Questi aumenti di biodisponibilità’ possono determinare una grave tossicità.

(Tratto da “Intoduction to Food Toxicology”, second edition, Takayuki Shibamoto and Leonard F. Bjeldanes, Food Science and Technology, International Series, Academic Press, 2009)

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