Ruolo della caspasi-8 nel timo

Riassunto.

Il timo è l’organo principale responsabile della nuova generazione di cellule T immocompetenti che posseggono un repertorio vario di riconoscimento dell’antigene. Durante il processo di sviluppo, il 98% dei timociti muoiono per apoptosi. Quindi l’apoptosi è un processo dominante nel timo ed avviene o attraverso la morte da “neglect” o per selezione negativa o ancora attraverso la sua induzione nello stress/invecchiamento. L’attivazione caspasica è una parte essenziale del meccanismo generale dell’apoptosi, e i dati suggeriscono che le caspasi potrebbero avere un ruolo nella selezione negativa; tuttavia, sembra più probabile che l’attivazione di caspasi-8 sia coinvolta nella morte da neglect, in particolare nell’apoptosi timocitaria indotta dai glucocorticoidi. La caspasi-8 è attiva in timociti doppio-positivi (DP) in vivo e può essere attivata in vitro in timociti DP attraverso la stimolazione del recettore delle cellule T (TCR) per indurre apoptosi. La caspasi-8 è un membro proapoptotico della famiglia delle caspasi ed è considerata una caspasi iniziatrice, che viene attivata in seguito a stimolazione di un recettore di morte (per es., Fas), a reclutamento della molecola adattatrice FADD, ed al reclutamento e successivo processamento della procaspasi-8. Sembra che il ruolo principale della caspasi-8 sia pro-apoptotico ed, in questa rassegna, discuteremo del coinvolgimento della caspasi-8 nella (1) apoptosi timica stimolata dal TCR; (2) apoptosi timica mediata da recettori di morte; e (3) apoptosi timica indotta dai glucocorticoidi. Riguardo la stimolazione del TCR, la caspasi-8 è attiva in timociti midollari, semi-maturi con elevata espressione dell’antigene heat-stable (HAShi SP) come conseguenza di una stimolazione forte del TCR. Il recettore di morte Fas, con le molecole FADD e FLIP sono coinvolti a monte dell’attivazione della caspasi-8 in apoptosi; mentre Bid e HDAC7 sono coinvolti a valle della caspasi-8. Infine, la caspasi-8 è coinvolta nell’apoptosi timocitaria indotta dai glucocorticoidi attraverso un circuito di attivazione con la proteina GILZ. GILZ attiva la caspasi-8, promuovendo la sumolazione di GILZ e la sua protezione dalla degradazione proteasomica.

Fatti

  • Caspasi-8 è un membro pro-apoptotico della famiglia di proteasi cisteiniche delle caspasi
  • Caspasi-8 è attivata nel complesso di segnale che induce morte (DISC), che è indotto dal segnale del recettore di morte per partecipare alle vie estrinseca (attaverso il taglio diretto della caspasi-3) ed intrinseca (attraverso il taglio di Bid) dell’apoptosi
  • L’apoptosi è un processo fondamentale nella fisiologia timica dal momento che media la morte da neglect (90% dei timociti) e la selezione negativa di cloni autoreattivi (5% di tutti i timociti) per prevenire lo sviluppo di malattie autoreattive
  • L’assenza di caspasi-8 porta alla morte dei topi in utero. La mancanza ereditaria di caspasi-8 nell’uomo porta allo sviluppo di una malattia da immunodeficienza chiamata Stato di Deficienza della Caspasi-8 (CEDS)

Domande aperte

  • La via caspasi-8-dipendente e Fas-indipendente è coinvolta nella selezione negative timica o, più generalmente, nell’apoptosi timica?
  • L’inibizione dell’attivazione di caspasi-8 è importante nell’innalzare la resistenza verso la terapia farmacologica in malattie timiche, come i timomi?
  • Migliorare la comprensione delle relazioni tra caspasi-8, le diverse forme di c-FLIP e RIPK1/RIPK3 si potrebbe rivelare cruciale nel controllare le funzioni timocitarie verso l’apoptosi, la necroptosi o la proliferazione?
  • Qual’è il ruolo biologico nella funzione timica della sumolazione/ubiquitinazione dipendente da caspasi-8 di diversi substrati?

Il timo è l’organo principale responsabile della generazione di nuove cellule T immunocompetenti con un repertorio vario per il riconoscimento dell’antigene. Tuttavia, questo organo diminuisce in dimensioni con l’età in un processo chiamato involuzione timica, che è evolutivamente conservato nei vertebrati. Il timo è composto di timociti di origine ematopoietica e cellule epiteliali timiche (TEC) di origine non ematopoietica. Queste ultime comprendono la nicchia stromale principale, denominata spazio epiteliale timico, che è coinvolto nel sostenere lo sviluppo e la maturazione delle cellule T. Lo sviluppo delle cellule T nel timo è complesso, ed avviene attraverso un processo multifasico di proliferazione, differenziazione, ed apoptosi. Questo processo produce un repertorio di cellule T capaci di colonizzare gli organi linfoidi periferici per difendere l’organismo contro patogeni infettanti e di eliminare le cellule T autoreattive per cercare di evitare l’insorgenza di malattie autoimmunitarie. Il processo dello sviluppo di cellule T da precursori derivati dal midollo osseo a linfociti T completamente maturi può necessitare fino ad 1 settimana di tempo. Il timo di un topo giovane adulto contiene circa 108-2 x 108 timociti. All’incirca ogni giorno vengono generate 5 x 107 nuove cellule; tuttavia, soltanto da 106 a 2 x 106 (2-4%) di queste cellule circa lasciano il timo ogni giorno come cellule T mature. Nonostante la disparità tra il numero di cellule T generato ed il numero che esce, il timo non continua a crescere in dimensioni o come numero di cellule. Ciò avviene perché il 98% circa dei timociti che si sviluppano nel timo sono eliminate per apoptosi. Questo processo di eradicazione riflette lo stretto monitoraggio a cui ogni timocita deve andare incontro in modo che l’organismo possa riconoscere i complessi auto-peptide/auto-MHC e sviluppare auto-tolleranza.

L’apoptosi nel timo avviene attraverso morte da neglect o per selezione negativa. E’ stato dimostrato anche che lo stress e l’invecchiamento inducono apoptosi in questo organo. Timociti doppio poisitivi (DP) CD4+CD8+ che non riescono a generare recettori per l’antigene funzionali o non ricevono nessun segnale nel recettore delle cellule T (TCR) muoiono per neglect, mentre timociti potenzialmente autoreattivi sono eliminati per apoptosi attraverso la selezione negativa (figura 1). La morte per neglect avviene in timociti DP con una insufficiente affinità per gli auto-antigeni; tuttavia, il meccanismo preciso di questo processo rimane non risolto. La selezione negativa dipende dall’interazione tra il peptide antigenico (estraneo) associato a molecole MHC sulla superficie delle TEC midollari (mTEC), ed il complesso del TCR sulla superficie dei timociti DP. Se questo legame è forte, i timociti DP vanno incontro ad apoptosi e i cloni di timociti autoreattivi sono selezionati negativamente. Quindi, l’interazione appropriata tra le mTEC ed il complesso del TCR sui timociti DP è cruciale per distinguere tra i timociti selezionati positivamente o negativamente.

Sono stati descritte due principali vie che portano all’apoptosi nel timo, e cioè le vie intrinseca ed estrinseca. La caspasi-8, un membro della famiglia caspasica delle proteasi cisteiniche apoptotiche, è coinvolta in entrambe le vie. Considerata una caspasi iniziatrice, questa proteasi consiste di un dominio n-terminale di dimerizzazione relativamente grande e di un dominio effettore di morte (DED, presente nella caspasi-8 e -10). Come altre caspasi iniziatrici, la caspasi-8 è espressa come monomero che necessita di dimerizzare per attivarsi.

La caspasi-8 si attiva attraverso il DISC in seguito al segnale del recettore di morte. In seguito al legame, i recettori di morte come il Fas multimerizzano nella membrana cellulare, determinando un cambiamento conformazionale nel dominio intracellulare del recettore.

Questo, a sua volta, porta al reclutamento ed alla multimerizzazione della proteina adattatrice FADD, che contiene un dominio di morte che interagisce con il recettore ed un DED che recluta la caspasi-8 monomerica. La caspasi-8 va incontro, quindi, a dimerizzazione ed attivazione per induzione da prossimità. Il successivo taglio della caspasi-8 stabilizza il dimero e porta a specie caspasiche con aumentata attività. Infine, la caspasi-8 si auto-taglia tra i DED e le subunità grandi, determinando il rilascio dal DISC di un dimero stabile. Un destino alternativo è la formazione di un eterodimero con un omologo della caspasi-8, cellular FLICE inhibitory protein (cFLIP), anch’esso reclutabile nel DISC. Questo omologo contiene mutazioni all’interno del sito catalitico che possono inibire l’attivazione di caspasi-8. Questa molecola può essere suddivisa in due isoforme, lunga (cFLIPL) e corta (cFLIPS). FLIPS inibisce l’attivazione di caspasi-8, mentre l’eterodimero caspasi-8/FLIPL, che contiene la caspasi-8 non processata, promuove il segnale verso la sopravvivenza e l’attivazione cellulare piuttosto che verso l’apoptosi. Solo dopo che la subunità della caspasi-8 in questo eterodimero è stata processata, questa caspasi diviene pro-apoptotica. Una volta attivata (cioè, tagliata), la caspasi-8 può tagliare direttamente ed attivare la caspasi-3 attraverso la via estrinseca. In alternativa, la caspasi-8 attivata taglia Bid, che stimola il rilascio di citocromo c dai mitocondri che, a sua volta, determina l’attivazione di caspasi-9 e, infine, di caspasi-3 attraverso la via intrinseca. Quindi, l’attivazione di caspasi-8 è strettamente legata alla stimolazione del recettore di morte. Dal momento che Bid è un bersaglio dell’attività di caspasi-8/10, è stato proposto che le vie intrinseca ed estrinseca siano interconnesse, anche se probabilmente solo in certe cellule o tessuti. In assenza dell’attivazione caspasica, può essere stimolata un’altra forma di morte cellulare programmata, adesso chiamata genericamente “necroptosi” o “necrosi programmata”. All’attivazione di questa via si oppongono attivamente le caspasi, soprattutto la caspasi-8. La caspasi-8 attiva taglia RIPK1, inibendo così la necroptosi delle cellule dipendente da RIPK1. Per una rassegna dettagliata sulle caratteristiche generali della caspasi-8, indirizziamo il lettore alla rassegna di Van Raam e Salvesen.

I topi con assenza del gene caspasi-8 mostrano il fenotipo più drammatico tra tutti gli animali con assenza dei geni delle caspasi. Questi animali muoiono in utero all’incirca al giorno 11 di gestazione con difetti primari dello sviluppo cardiaco, ritardo di crescita, e deficienza di progenitori ematopoietici. E’ importante notare che la diminuzione dei geni di altre due componenti della via di attivazione della caspasi-8, FADD e FLIPL, determinano un fenotipo simile. Questi risultati indicano che il DISC e l’attivazione di caspasi-8 non solo sono critici per stimolare l’apoptosi ma sono anche essenziali per lo sviluppo embrionale. Inoltre, la caspasi-8 cataliticamente attiva è necessaria per salvare lo sviluppo dei linfociti in topi deficienti di caspasi-8. Nell’uomo, la deficienza di caspasi-8 non previene lo sviluppo. Individui omozigoti manifestano una apoptosi ed omeostasi linfocitaria difettiva e mostrano anche difetti nell’attivazione di linfociti T, linfociti B, e cellule natural killer, che portano ad immunodeficienza.

Nonostante la caspasi-8 sia anche coinvolta nella sopravvivenza e nello sviluppo, questa proteasi funziona principalmente nella stimolazione dell’apoptosi. In questa rassegna, discuteremo il ruolo delle (1) caspasi nell’apoptosi timica; (2) della caspasi-8 nell’apoptosi timica stimolata dal TCR; (3) della caspasi-8 nell’apoptosi timica mediata da recettori di morte; e (4) della caspasi-8 nell’apoptosi indotta da GC.

Importanza dell'apoptosi nel timo. Lo sviluppo dei timociti verso cellule T mature avviene all'interno del timo. Ci sono quattro fasi basilari in questo processo. (1) poche cellule CD4-CD8- DN (arancioni), che derivano dal midollo osseo, proliferano e si differenziano in cellule CD4+CD8+ DP. (2) la grande maggioranza (80%) di queste cellule muoiono per neglect (75%) o per selezione negativa (5%) (cellule viola). Solo una piccola percentuale di timociti sopravvive per selezione positiva, e queste diventano (3) cellule CD4+ SP (cellule rosse) o cellule CD8+ SP (turchesi) pronte ad emigrare verso gli organi linfatici periferici

Importanza dell’apoptosi nel timo. Lo sviluppo dei timociti verso cellule T mature avviene all’interno del timo. Ci sono quattro fasi basilari in questo processo. (1) poche cellule CD4-CD8- DN (arancioni), che derivano dal midollo osseo, proliferano e si differenziano in cellule CD4+CD8+ DP. (2) la grande maggioranza (80%) di queste cellule muoiono per neglect (75%) o per selezione negativa (5%) (cellule viola). Solo una piccola percentuale di timociti sopravvive per selezione positiva, e queste diventano (3) cellule CD4+ SP (cellule rosse) o cellule CD8+ SP (turchesi) pronte ad emigrare verso gli organi linfatici periferici

Caspasi ed apoptosi timica

La ricerca ha stabilito che l’attivazione caspasica ha un ruolo essenziale in apoptosi. Tuttavia, il ruolo delle caspasi nella selezione negativa timica rimane non chiara. Nonostante alcuni studi abbiano precedentemente riportato che la delezione timocitaria mediata dal peptide possa essere bloccata dall’inibitore pan-caspasico zVADFMK, rapporti più recenti mostrano che zVAD-FMK è inefficace nel fermare la selezione negativa in topi transgenici per il TCR. L’analisi dei topi transgenici che esprimono p35, un inibitore caspasico generale che lega caspasi-1, -3, -4, -6, -7, e -8, ha portato a risultati misti riguardo l’attività caspasica nella selezione negativa. Inoltre, l’abrogazione di Apaf-1, che fa parte del complesso citocromo c/Apaf-1/caspasi-9, non perturba la selezione negativa. Tuttavia, l’aumentata espressione dell’inibitore dell’apoptosi (IAP), una proteina che lega ed inibisce l’attività caspasica, porta ad una parziale inibizione della selezione negativa. Presi insieme, questi dati suggeriscono che le caspasi potrebbero avere un ruolo nella selezione negativa; tuttavia, è stato mostrato che da sole le vie indipendenti dalle caspasi sono insufficienti nell’indurre selezione negativa. Queste vie potrebbero includere la traslocazione dell’apoptosis-inducing factor (AIF) o della DNasi EndoG dai mitocondri al nucleo ed altre vie non identificate. Nonostante ciò, sembra più probabile che l’attivazione caspasica sia coinvolta nella morte da neglect e, specificamente, nell’apoptosi timocitaria indotta da GC che potrebbe essere coinvolta in questo processo. Infine, solo alcune caspasi, come le proteasi simil caspasi-3 e caspasi-8 ma non caspasi-1, sono attive nei timociti DP in vivo e possono essere attivate quando i timociti DP vanno incontro ad apoptosi in vitro attaverso stimolazione del TCR.

Caspasi-8 nell’apoptosi timocitaria stimolata dal TCR.

Nel timo, la stimolazione del TCR rappresenta una fase cruciale per la selezione positiva dei linfociti T, per la selezione negativa dei cloni timocitari autoreattivi, e della morte da neglect. Perché questo processo avvenga, devono attecchire almeno due diversi parametri, l’intensità della stimolazione del TCR e la sottopopolazione timica coinvolta. L’intensità di stimolazione del TCR determina il destino della cellula stimolata. Se l’intensità è bassa o assente, i timociti moriranno per neglect; tuttavia, con una stimolazione moderata, i timociti sopravviveranno e saranno selezionati positivamente. Una stimolazione forte del TCR promuove l’apoptosi timocitaria per selezione negativa.

               A questo processo partecipano almeno due sottopopolazioni timiche: timociti DP (la sottopopolazione principalmente coinvolta) e i timociti midollari semi-maturi con alto antigene heat-stable (HSAhi) CD4+CD8singolo positivi (SP). La stimolazione del TCR dei timociti DP porta ad apoptosi indipendente da Fas indipendentemente dalla forza della stimolazione del TCR. Questo meccanismo è stato identificato sulla base di studi su cellule di topi lpr/lpr deficienti di Fas e su topi non-obesi diabetici (NOD). D’altro canto, nei timociti midollari semi-maturi HSAhi CD4+CD8 SP, l’apoptosi indotta dal TCR è indipendente da Fas in seguito a stimolazione del TCR bassa/intermedia ma è dipendente da Fas/caspasi-8 con una forte stimolazione del TCR. Queste scoperte sono state osservate anche in vivo in topi transgenici per il TCR iniettati con il peptide. Quindi, l’attivazione di caspasi-8 in timociti DP è indipendente da Fas, mentre l’attivazione di caspasi-8 in timociti midollari semi-maturi HSAhi CD4+CD8 SP è dipendente da Fas come conseguenza di una stimolazione forte del TCR (Figura 2). In topi lpr/lpr e NOD deficienti di Fas, il difetto dell’apoptosi dipendente da Fas/caspasi-8 in seguito a forte stimolazione del TCR è associata a predisposizione verso lo sviluppo di malattie autoimmunitarie. Queste osservazioni suggeriscono che l’attivazione di caspasi-8 dipendente da Fas potrebbe essere, almeno in parte, coinvolta nell’eliminazione di cloni di cellule T autoreattive attraverso selezione negativa. Questo difetto era preminente soprattutto in timociti midollari semi-maturi HSAhi CD4+CD8 SP ed è correlato con l’aumentata espressione di cFLIP, il principale inibitore dell’attivazione di caspasi-8 nel DISC, in risposta ad un segnale forte del TCR. Nonostante ciò, il ruolo di cFLIP risulta complesso. Nonostante l’inibizione dell’apoptosi dipendente da Fas/caspasi-8, il numero dei timociti in topi transgenici per FLIP virale è più basso rispetto ai topi di controllo. Inoltre, questi timociti rispondono alla stimolazione mediata dal CD3, suggerendo che la stimolazione mediata dal TCR possa essere indipendente da Fas/caspasi-8. A supporto di questa possibilità, è stato mostrato che cFLIP stimola la via necroptotica dipendente da RIPK1/RIPK3 che determina morte cellulare. Un altro importante regolatore negativo dell’apoptosi coinvolto nella morte cellulare timocitaria mediata da TCR è Fas apoptosis inhibitory molecule (FAIM). L’espressione di FAIM è aumentata nei timociti in seguito a stimolazione del TCR e blocca l’attività di caspasi-8 e -9. I timociti FAIM-/- sono, infatti, altamente suscettibili all’apoptosi mediata dal TCR con aumentata attivazione di caspasi-8 e -9. Inoltre, l’iniezione di anticorpi anti-CD3 porta ad aumentata deplezione di cellule T CD4+CD8+ nel timo di topi FAIM-/- in paragone ai controlli, il chè suggerisce che FAIM possegga un ruolo nell’inibire l’apoptosi timocitaria. La stimolazione del TCR in timociti FAIM-/- porta ad un elevato livello del recettore nucleare orfano Nur77, che ha un ruolo nell’apoptosi timocitaria. E’ interessante notare che, in assenza di FAIM, l’ubiquitinazione e degradazione di Nur77 è ridotta. I timociti FAIM-/- esibiscono anche un difetto nell’attivazione indotta dal TCR di Akt, la cui attività è necessaria per l’ubiquitinazione di Nur77. Ulteriori analisi che utilizzano timociti primari deficienti di FAIM e cellule T DO-11.10 con aumentata espressione di FAIM indicano che FAIM agisce a monte ad Akt, promuovendo quindi la sua localizzazione nei raft lipidici ed influenzandone l’attivazione. Presi insieme, questi studi definiscono un’asse di segnale FAIM/Akt/Nur77 indotta da TCR che è critico nel modulare l’apoptosi dei timociti in sviluppo. Un’ipotesi intrigante propone che FAIM potrebbe essere coinvolto quando la stimolazione del TCR fa slittare il destino dei timociti verso la sopravvivenza (selezione positiva) invece della morte (selezione negativa).

Figura 2. Apoptosi timocitaria stimolata dal TCR. La stimolazione del TCR determina apoptosi in due tipi di sottopopolazioni timocitarie: cellule (1) CD4+CD8+ DP e (2) HAS(hi)CD4+CD8- SP. L'apoptosi è dipendente dalla via Fas/caspasi-8 solo nel caso in cui ci sia una stimolazione forte del TCR in cellule HAS (hi)CD4+CD8- SP.

Figura 2. Apoptosi timocitaria stimolata dal TCR. La stimolazione del TCR determina apoptosi in due tipi di sottopopolazioni timocitarie: cellule (1) CD4+CD8+ DP e (2) HAS(hi)CD4+CD8- SP. L’apoptosi è dipendente dalla via Fas/caspasi-8 solo nel caso in cui ci sia una stimolazione forte del TCR in cellule HAS (hi)CD4+CD8- SP.

Coinvolgimento della caspasi-8 nell’apoptosi timocitaria stimolata da recettori di morte

Informazioni indirette sul coinvolgimento dell’attivazione di caspasi-8 nell’apoptosi timocitaria dipendente da recettori di morte deriva da studi in cui vengono inibite o geneticamente eliminate molecole a monte o a valle della caspasi-8 (Figura 3)

Figura 3. Molecole coinvolte nella via della caspasi-8 nel timo. La caspasi-8 è attivata attraverso la stimolazione di Fas ed il reclutamento di FADD. Le molecole a monte che regolano negativamente questa via sono FAIM e FLIP, mentre MSSP regola positivamente la via Fas/caspasi-8. Una volta attivata, a valle caspasi-8 taglia ed attiva caspasi-3, HDAC7, e Bid, promuovendo così l'apoptosi timocitaria.

Figura 3. Molecole coinvolte nella via della caspasi-8 nel timo. La caspasi-8 è attivata attraverso la stimolazione di Fas ed il reclutamento di FADD. Le molecole a monte che regolano negativamente questa via sono FAIM e FLIP, mentre MSSP regola positivamente la via Fas/caspasi-8. Una volta attivata, a valle caspasi-8 taglia ed attiva caspasi-3, HDAC7, e Bid, promuovendo così l’apoptosi timocitaria.

Molecole a monte

Fas: il lavoro di Kishimoto e Sprent indica che la via di Fas è coinvolta nella selezione negativa ma solo in una piccola popolazione di timociti SP semi-maturi. Tuttavia, la via di Fas è attiva nei timociti DP, indicando il suo coinvolgimento in altri processi che non siano quelli della selezione negativa e quindi, probabilmente, nella morte da neglect. Di tutte le vie dei recettori di morte, il segnale di Fas ha un ruolo critico nell’apoptosi timocitaria; quindi, l’espressione del recettore Fas deve essere strettamente regolata nei timociti. Come già menzionato, FAIM è un regolatore negativo di Fas. Un regolatore positivo di Fas è MSSP, un fattore di trascrizione che regola c-myc, actina alpha liscia, MHC classe I, MHC classe 2, e recettore della tireotropina. I timociti dei topi geneticamente assenti di MSSP esibiscono una ridotta espressione di Fas, che risulta nell’abrogazione dell’induzione dell’apoptosi mediata da Fas/caspasi-8. Inoltre, la distruzione dei raft lipidici a causa della deplezione di colesterolo abolisce il reclutamento in membrana di FADD e caspasi-8 stimolato da Fas, la formazione del DISC, e la morte cellulare.

FADD: come già menzionato, in seguito a stimolazione, Fas recluta FADD che, a sua volta, recluta caspasi-8 per formare il DISC. FADD è critico per la vitalità dal momento che topi omozigoti deficienti di FADD muoiono in utero. In chimere neonate, i timociti di animali FADD-/- sono completamente resistenti all’apoptosi mediata da Fas ma meno sensibili all’apoptosi mediata da TNF, indicando una assenza di ridondanza nelle vie apoptotiche mediate da Fas. Tuttavia, le sottopopolazioni timocitarie erano apparentemente normali, dal momento che ricordavano quelle dei topi normali di controllo, mentre il numero dei timociti diminuiva fino ad un livello non rilevabile con l’età. Questi risultati insieme alle similitudini osservate tra topi FADD-/- e topi deficienti di IL-2R beta suggeriscono che: (1) l’attivazione della caspasi-8 dipendente da Fas/FADD non è cruciale per lo sviluppo dei timociti e (2) che c’è una associazione inaspettata tra proliferazione cellulare ed apoptosi. Quest’ultima potrebbe essere dovuta agli effetti proliferativi mediati da caspasi-8. I dati da topi deficienti di FADD pubblicati da Winoto e colleghi sono stati recentemente confermati in un altro modello. E’ stato mostrato che topi deficienti di FADD specificamente nelle cellule T posseggono un numero normale di timociti ed un numero leggermente ridotto di cellule T periferiche, mentre la delezione di FADD specifica nelle cellule B porta ad un aumento dei numeri delle cellule B periferiche.

cFLIP: cFLIP può essere reclutato dal FADD nel DISC al posto o in associazione alla caspasi-8. Nonostante cFLIPS sia composto soltanto dai due DED, in aggiunta a questi domini, cFLIPL contiene un dominio simil-caspasico (inattivo) che rende la proteina strutturalmente simile alla pro-caspasi-8. Sia cFLIPS che c-FLIPL sopprime l’apoptosi attraverso l’inibizione dell’attivazione di caspasi-8, anche se a livelli diversi di processamento della pro-caspasi-8. Per investigare le conseguenze della espressione disregolata di cFLIPS in vivo, sono stati prodotti topi transgenici lck/cFLIPS che esprimono cFLIPS in eccesso in timociti e cellule T mature. Come ci si aspettava, l’apoptosi indotta da Fas ligando era alterata in queste cellule T transgeniche. Tuttavia, il numero cellulare del timo e della milza, così come la cellularità CD4/CD8, in questi animali erano normali. Differentemente dai topi deficienti di Fas, nei topi transgenici lck/cFLIPS le cellule T periferiche Thy+B220+CD4CD8 non si accumulano. Nonostante la capacità di cFLIPS di inibire l’apoptosi indotta da Fas, nei topi transgenici lck/cFLIPS non si osserva linfomagenesi delle cellule T. E’ interessante notare che il numero di cellule T della memoria Vβ8+ aumentavano in seguito ad iniezione con enterotossina B stafilococcica, suggerendo una specifica funzione in vivo per cFLIPS nel mantenimento delle cellule T ri-stimolate. Infine, nei topi transgenici di 4-8 settimane che esprimono cFLIPS in eccesso in cui i timociti erano resistenti all’apoptosi indotta da Fas il numero totale dei timociti era ridotto, suggerendo ulteriormente che l’attivazione di caspasi-8 e l’apoptosi dipendente da Fas non sono coinvolte nello sviluppo dei timociti. E’ rilevante che questa riduzione si osserva anche in topi transgenici per FLIP con una base Fas-/-, suggerendo che questa riduzione è indipendente da Fas.

                TRAIL: L’importanza dei recettori di morte della famiglia del TNF, diversi da Fas, nella selezione negativa timocitaria è stato il soggetto di molti studi, con risultati equivoci. Quindi, per chiarire il ruolo della via FADD/caspasi-8 in questo processo, è stata investigata la selezione negativa intratimica di timociti deficienti di TRAIL usando quattro modelli ben conosciuti, tra cui la stimolazione in vitro mediata da anticorpi del TCR/CD3, la stimolazione in vivo ed in vitro con superantigene endogeno, ed il trattamento con superantigene esogeno in vitro. Questi modelli non sono stati capaci di dimostrare che il segnale di TRAIL ha un ruolo, suggerendo che questa via non è un fattore critico per la selezione negativa timocitaria.

                IRF5: E’ stato recentemente mostrato che il fattore di trascrizione IFN regulatory factor 5 (IRF5), che è coinvolto nell’attivazione delle risposte immuni innate, è critico per l’apoptosi indotta dal danno al DNA e per la soppressione tumorale. In particolare, IRF5 è coinvolto in uno stadio del segnale di Fas che precede l’attivazione di caspasi-8 e c-Jun N-terminal kinase. Oltre che negli epatociti, IRF5 è anche necessario per l’apoptosi delle cellule dendritiche (DC) attivate da CpG ipometilati ma non in timociti e fibroblasti embrionali in vitro. Quindi, queste scoperte rivelano una funzione di IRF5 specifica per tipo cellulare nel complesso meccanismo regolatorio dell’apoptosi indotta da recettori di morte.

Molecole a valle

Bid: Studi con topi deficienti di Bid hanno dimostrato che questo membro pro-apoptotico della famiglia Bcl-2 non è coinvolto nello sviluppo timocitario. Quando timociti Bid-/- venivano trattati in vitro con anticorpi anti-Fas, la caspasi-8 rimaneva attiva, ma la via apoptotica mitocondriale dipendente da caspasi-8 era bloccata. In questi timociti, la disfunzione mitocondriale era ritardata, il citocromo c non veniva rilasciato, l’attività delle caspasi effettrici era ridotta, ed il taglio dei substrati apoptotici era alterato. Quindi, la via apoptotica mitocondriale mediata da Fas/caspasi-8 è importante nei timociti, ma questa via non sembra essere critica per lo sviluppo timocitario.

Istone Deacetilasi 7 (HDAC7): Molti nuovi possibili substrati della caspasi-8 sono stati identificati grazie al programma di predittività della specificità delle proteasi. Una di queste proteine è HDAC7, che si è visto va incontro al taglio più velocemente di qualsiasi altro substrato di caspasi-8 che si conosca. Vari studi hanno dimostrato che HDAC7 è tagliato in timociti primari CD4+CD8+ che vanno incontro ad apoptosi estrinseca. E’ importante notare che il taglio di HDAC7 altera la sua localizzazione subcellulare ed abroga la sua capacità di reprimere Nur77. Quindi, questi dati dimostrano un ruolo diretto della proteolisi mediata da caspasi iniziatrici nel promuovere la trascrizione genica. In timociti immaturi CD4+CD8+, HDAC7 reprime, infatti, la trascrizione di Nur77, una proteina pro-apoptotica coinvolta nella morte dei linfociti T durante la selezione negativa. La stimolazione del recettore delle cellule T nei timociti immaturi inizia l’esportazione nucleare di HDAC7. Questo porta ad una perdita della repressione trascrizionale e all’induzione dipendente da MEF2D di Nur77 e all’apoptosi.

                Possono essere supposti due possibili risultati del taglio mediato da caspasi-8 di HDAC7 nei timociti. Primo, il taglio potrebbe promuovere l’espressione di Nur77 ed indirizzare verso un aumento dell’apoptosi. Ciò potrebbe essere importante per promuovere l’apoptosi in cellule che hanno ridotti livelli di caspasi esecutrici o elevati livelli di inibitori dell’apoptosi, come XIAP. In alternativa, se il frammento N-terminale tagliato viene riportato nel nucleo, potrebbe risultarne un effetto di dominanza negativa. Il frammento N-terminale di HDAC7 generato dalla caspasi potrebbe legare MEF2D, prevenendo la trascrizione di Nur77 in un modo che non potrebbe essere spento, in quanto non potrebbe essere esportato nel nucleo, promuovendo la sopravvivenza cellulare dei timociti. Questa ipotesi è messa in dubbio dalla riconosciuta instabilità del frammento N-terminale di HDAC7 generato dalla caspasi.

Ruolo della caspasi-8 nell’apoptosi dei timociti indotta dai GC.

Nonostante l’inizio dell’apoptosi timica indotta dai GC si basi sul recettore dei GC (GR) e sulla espressione genica indotta, la fase effettrice differisce nei diversi tipi cellulari. La degradazione proteasomica, così come l’attività delle caspasi-3, -8, e -9, è essenziale per l’apoptosi indotta dai GC nei timociti murini; tuttavia, questi enzimi non sono indispensabili nelle cellule T spleniche. Il ruolo dell’apoptosi indotta dai GC, incluso il coinvolgimento della caspasi-8, nel timo è controverso. Nonostante alcuni studi abbiano dimostrato che l’attivazione della caspasi-8 non sia indispensabile per l’apoptosi timocitaria, altri studi hanno invece dimostrato che essa è critica. Mann et al. hanno mostrato che sia l’apoptosi timocitaria spontanea che quella indotta da GC sono associate sia con la depolarizzazione cellulare che con la repressione dell’ATPasi-Na+/K+. Questi effetti venivano bloccati dall’inibitore pan-caspasico (zVAD) ma non da inibitori specifici della caspasi-8, -9, e -3. Tra i GC, il metilprednisolone (MPS) induce apoptosi in fase precoce nei timociti dei ratti, come è indicato da un aumento degli eventi positivi all’annessina-V e dal sequenziale aumento della produzione di NO da parte delle membrane mitocondriali e del reticolo endoplasmico. L’MPS attiva la caspasi-6 e la caspasi-3 ma non la caspasi-8. Infine, la via apoptotica timocitaria indotta da MPS coinvolge principalmente i mitocondri ma non il reticolo endoplasmico. Altri studi si sono focalizzati sul ruolo critico della caspasi-8 nell’apoptosi timocitaria indotta dai GC. In un modello di apoptosi timocitaria in vitro, l’inibizione della caspasi-8 abroga il rilascio di citocromo c, l’attivazione di caspasi-9 e di caspasi-3 e l’apoptosi, suggerendo che l’inibizione della caspasi-8 possa indirettamente inibire la caspasi-9 e/o che l’attivazione di caspasi-8 indotta dal desametasone (DEX) è a monte dei mitocondri. Quindi, essa può regolare la caspasi-3 direttamente oppure attraverso il rilascio di citocromo c e, in ultima analisi, l’attivazione di caspasi-9 e caspasi-3. Eventi di segnale critici a monte dell’attivazione di caspasi-8 includono l’espressione src chinasi, di PI-PLC, e di aSMase dal momento che l’inibizione della loro sintesi abolisce il processamento della caspasi-8 e l’apoptosi. Un altro studio ha mostrato che l’attivazione di caspasi-8 potrebbe essere critica per promuovere l’apoptosi timocitaria indotta dai GC. Più specificamente, l’apoptosi timocitaria murina era iniziata dal coinvolgimento di caspasi-8, -3, e -9 indotto dal DEX insieme alla perdita del potenziale di membrana mitocondriale indipendente da caspasi-8. E’ stato trovato che questa apoptosi indotta dal DEX è mediata, almeno in parte, dalla sfingosina che, insieme all’attività del proteasoma, contribuisce al processamento della caspasi-8 e della caspasi-3 indipendentemente dai mitocondri.

                Oltre a promuovere l’apoptosi timocitaria, i GC modulano la trascrizione di numerosi geni che hanno un ruolo importante nello stimolare l’apoptosi timica. Per esempio, l’espressione di GC-induced leucine zipper (GILZ) è fortemente aumentata nel timo ed è stato dimostrato che questa proteina è coinvolta nello sviluppo timico. GILZ è stata in origine identificata nel 1997, durante uno studio sistematico su geni trascrizionalmente indotti dai GC e responsabili dell’apoptosi attivata dai GC. In seguito, è stato visto che GILZ media molte funzioni dei GC, come la modulazione dell’attivazione delle cellule T, la produzione di IL-2, l’apoptosi, e la proliferazione cellulare. Dal momento in cui le caratteristiche di base e la regolazione della proteina GILZ sono state chiarite, sono incominciate ad emergere molte caratteristiche inaspettate di questa proteina, che hanno fornito nuove conoscenze sul ruolo fisiologico e sulla funzione di GILZ stesso. A causa della varietà delle sue interazioni proteiche e della sua abbondanza in molti tipi cellulari, GILZ ha, infatti, un ruolo cruciale nel controllo del traffico proteico e del segnale. Più recentemente, sono state definite nuove funzioni, tra cui la regolazione della differenziazione delle cellule T helper e la funzione DC, l’aumento del trasporto di Na+ mediato da canali epiteliali Na+ nel rene, ed il controllo della trasformazione maligna attraverso l’inibizione della tumorigenesi guidata da Ras. Topi transgenici giovani adulti che esprimono GILZ in eccesso mostrano un numero di timociti CD4+CD8+ drammaticamente ridotto ed un aumento ex vivo dell’apoptosi timocitaria. L’analisi della via apoptotica ha rilevato una ridotta espressione di Bcl-xL antiapoptotico ed una aumentata attivazione di caspasi-8 e caspasi-3 in maniera sequenziale. Nei topi più vecchi transgenici per GILZ, la perturbazione dei numeri delle sottopopolazioni timiche si amplifica nel tempo, come è dimostrato dall’ulteriore riduzione delle cellule CD4+CD8+ e dall’aumento del numero delle cellule CD4+CD8, CD4CD8, e CD4+CD8. Quindi, sembra che GILZ faccia parte di una nuova via pro-apoptotica. E’ stata anche valutata una possibile relazione tra GILZ e caspasi-8 nei timociti trattati con DEX. L’espressione della proteina GILZ indotta dal DEX era ridotta quando l’attività di caspasi-8 veniva inibita. L’inibizione del proteasoma abrogava questa riduzione dell’espressione di GILZ, suggerendo che l’attivazione di caspasi-8 indotta dal DEX protegge GILZ dalla degradazione. E’ stato ipotizzato che tale protezione di GILZ dipendente da caspasi-8 possa essere dovuta alla sumolazione guidata da caspasi-8, che di conseguenza inibisce l’ubiquitinazione di GILZ. Infatti, il legame di GILZ a SUMO-1 in vitro ed in vivo è dipendente dall’attivazione di caspasi-8. Ciò correla con studi, riportati nello stesso articolo, su topi e linee cellulari deficienti di caspasi-8, che mostrano una concomitante riduzione dell’espressione di GILZ nei timociti e nei linfociti. Questi risultati suggeriscono che l’attivazione di caspasi-8 protegge GILZ dalla degradazione proteasomica ed induce il suo legame con SUMO-1 in timociti trattati con GC. Considerati insieme, questi risultati suggeriscono un circuito a retroazione tra GILZ e caspasi-8 che inizia con l’espressione genica di GILZ mediata dal GR. Una volta espresso, GILZ induce l’attivazione di caspasi-8, che a sua volta promuove il mantenimento di GILZ attraverso la sua sumolazione e la conseguente inibizione della propria degradazione da ubiquitinazione/proteasoma. Quindi, la trascrizione di GILZ dipendente dai GC è necessaria ma non sufficiente per la sua espressione. Per promuovere la sua espressione, i GC devono anche proteggere GILZ dalla degradazione proteasomica attraverso l’attivazione di caspasi-8 (Figura 4).

Figura 4. Il circuito GILZ-caspasi-8. Il legame dei GC al loro GR stimola la trascrizione di Gilz. Una volta che Gilz viene tradotto, attiva caspasi-8 dalla pro-caspasi-8, e la caspasi-8 attiva determina il legame di Sumo-1 a GILZ. Il legame di Sumo-1 compete con il legame dell'ubiquitina ed inibisce la degradazione proteasomica di GILZ.

Figura 4. Il circuito GILZ-caspasi-8. Il legame dei GC al loro GR stimola la trascrizione di Gilz. Una volta che Gilz viene tradotto, attiva caspasi-8 dalla pro-caspasi-8, e la caspasi-8 attiva determina il legame di Sumo-1 a GILZ. Il legame di Sumo-1 compete con il legame dell’ubiquitina ed inibisce la degradazione proteasomica di GILZ.

                A proposito del coinvolgimento da parte dei GC dei recettori di morte, il quadro di espressione di Fas e DR5, entrambe molecole che inducono morte cellulare attraverso caspasi-8, è stato analizzato nel timo o dopo irradiazione γ o dopo trattamento con DEX. Sia Fas che DR5 venivano indotti nel timo da radiazioni ionizzanti in maniera dipendente da p53, mentre solo DR5 veniva indotto dal DEX in maniera indipendente da p53. Gli studi hanno stabilito che caspasi-8 è attivata durante l’apoptosi timica indotta dai GC. Nonostante ciò, l’importanza di questa attivazione nell’economia del processo apoptotico nel timo rimane controversa. Le discrepanze osservate nei vari studi potrebbero essere dovute alle differenti condizioni sperimentali analizzate, come il tipo di GC usato, il ceppo di topi, e la diversa via apoptotica stimolata dai GC. GC differenti, infatti, hanno una diversa attività apoptotica che è correlata alla loro capacità di indurre sia effetti genomici (per es., attivazione di caspasi-8, -9, e -3 ed espressione di GILZ) che effetti non genomici (per es., fosforilazione di PI-PLC). Per esempio, immagini vitali tramite microscopio confocale hanno rivelato che la catepsina B lisosomale, un componenente finora non riconosciuto di questa via, diventa rapidamente attivo nei timociti dopo esposizione ai GC. Ciò è seguito da diffusione della catepsina B nel citosol, condensazione nucleare, e processamento della caspasi-8 e -3. Collettivamente, il programma apoptotico indotto dai GC consiste di specificità di tipo cellulare e caratteristiche condivise.

                Il significato biologico dell’apoptosi timocitaria indotta dai GC rimane non chiara. E’ ragionevole pensare che i GC possano partecipare alla morte da neglect e all’involuzione timica correlata all’età ed allo stress. Una nuova interessante scoperta suggerisce che l’apoptosi timocitaria dipendendente da caspasi-8 ed indotta dai GC sia coinvolta nell’atrofia timica come conseguenza di un’infezione acuta da Trypanosoma cruzi. Il blocco dell’attività del GR con RU486 previene l’apoptosi dei timociti DP insieme all’attivazione di caspasi-8 in un modello murino di iniezione acuta da T. cruzi. Queste scoperte indicano che l’apoptosi delle cellule T DP in seguito a infezione sperimentale con T. cruzi è dipendente dalla stimolazione dei GC che promuovono l’attivazione di caspasi-8.

 

Conclusioni

La caspasi-8 è una molecola critica dal momento che la sua assenza porta a morte dei topi in utero. In seguito ad attivazione, la sua principale funzione è di promuovere l’apoptosi e, nel timo, l’apoptosi da selezione negativa è critica per eliminare i cloni autoaggressivi di cellule T che, se non eliminati, potrebbero contribuire a sviluppare malattie autoimmuni. Nonostante il coinvolgimento della caspasi-8 nell’apoptosi, non ci sono evidenze chiare che dimostrano il coinvolgimento di caspasi-8 nell’alterare la tolleranza centrale timica. Quindi, il ruolo della caspasi-8 nel timo è ancora incerto, anche se ciò è probabilmente la conseguenza di una incapacità ad analizzare sperimentalmente questo tema. Come esempio, tutti i dati sulla caspasi-8 nel timo sono stati ottenuti dimunuendone l’espressione. Tuttavia, sarebbe molto informativo anche avere dati conseguenti ad un eccesso di espressione della caspasi-8. Una ipotesi alternativa è che il ruolo di caspasi-8 nell’apoptosi timica non sia critico, mentre la caspasi-8 sarebbe piuttosto coinvolta nella proliferazione timica. Questa ipotesi è sostenuta da studi sulla CEDS, una rara malattia umana in cui la principale manifestazione clinica è l’immunodeficienza, e ciò implica un coinvolgimento della caspasi-8 nella proliferazione timica piuttosto che nell’apoptosi. Questa rassegna mette in luce il ruolo della caspasi-8 nell’apoptosi stimolata dal TCR, in quella stimolata da recettori di morte, e in quella indotta dai GC. Rimangono aperte le domande sul fatto se il timo sia o no coinvolto nei sintomi autoimmuni presenti nell’uomo con deficienza di caspasi-8 e se ciò possa essere la conseguenza di una alterata selezione negativa. In aggiunta, è importante delucidare ulteriormente la nuova funzione della caspasi-8 nell’inibizione della degradazione proteasomica di altre molecole coinvolte nell’apoptosi e nella proliferazione accanto a GILZ: Studi futuri chiariranno questi dubbi e renderanno potenzialmente disponibili lo sviluppo di strategie terapeutiche che modulano l’attivazione di caspasi-8 per il trattamento dello stato di immunodeficienza o per altri disordini dipendenti da caspasi-8 al momento sconosciuti.

(Tratto da Pozzesi N, Fierabracci A, Liberati AM, Martelli MP, Ayroldi E, Riccardi C, Delfino DV, “Role of caspase-8 in thymus function”.  Cell Death Differ.  2014 Feb;21(2):226-33)

One Response to “Ruolo della caspasi-8 nel timo”

  1. mariocasagrande.altervista.org

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