Recenti scoperte sul ruolo della via PD-1/PD-L1 nella tolleranza immunologica e nell’autoimmunità

Riassunto

Le malattie autoimmuni rappresentano un gruppo eterogeneo di condizioni la cui incidenza è in aumento in tutto il mondo. Ciò ha stimolato studi sulla loro eziopatogenesi, derivata da una complessa interazione tra fattori genetici ed ambientali, con lo scopo di migliorare la prevenzione ed il trattamento di questi disordini.

E’ stata messa in luce la rilevanza delle cellule T regolatorie e della via PD-1/PD-L1 nel controllo delle risposte immuni. Studi recenti hanno in particolare delucidato il possibile ruolo della via PD-1/PD-L1 nel regolare le risposte delle cellule T ed il suo effetto sulla tolleranza immunologica e sul danno tessutale immuno-mediato.  Il ruolo della via PD-1/PD-L1 in autoimmunità è stato anche investigato in molti modelli sperimentali animali tra cui il diabete mellito dipendente da insulina, il lupus eritematoso sistemico, la miocardite, l’encefalomielite, l’artrite reumatoide e la malattia infiammatoria dell’intestino.  Con l’avvento degli studi di gene candidato, di associazione in genoma ampio, di polimorfismi nucleotidici singoli (SNP) nel gene PD-1 dell’uomo sono state dimostrate associazioni rilevanti con un elevato rischio di sviluppo di malattie autoimmunitarie in alcuni gruppi etnici.  In questa rassegna presentiamo le acquisizioni recenti sul ruolo della via PD-1/PD-L1 nella regolazione dell’attivazione linfocitaria, nella promozione dello sviluppo e delle funzioni delle cellule T regolatorie, nella perdita della tolleranza e nello sviluppo di autoimmunità.  Infine speculeremo sul possibile sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici in autoimmunità umana attraverso la modulazione della via PD-1/PD-L1.

Indice

  1. Introduzione
  2. Il ruolo fisiologico di PD-1 nell’attivazione linfocitaria
    1. Struttura molecolare ed espressione di PD-1 e del suo ligando
    2. La via PD-1-PD-L1 nell’attivazione linfocitaria
  3. Il segnale PD-1 e le Treg
  4. Ruolo della via PD-1-PD-L1 nello sviluppo e mantenimento della tolleranza
  5. 4.1       la via PD-1-PD-L1 e la tolleranza nei siti immunologicamente privilegiati
  6. Studi sul PD-1 nei modelli sperimentali animali di autoimmunità
    1. Disbete di tipo I
    2. Lupus eritematoso sistemico
    3. Miocardite
    4. Encefalomielite autoimmune
    5. Enteropatia autoimmune
    6. Artrite reumatoide
  7. Polimorfismi del PD-1 ed autoimmunità
  8. Considerazioni conclusive

Introduzione

            Le malattie autoimmuni sono un gruppo eterogeneo di “disordini complessi comuni” che colpiscono vari organi e sistemi.  Nonostante siano definiti come non-Mendeliani, spesso si presentano in raggruppamenti familiari.  Nella loro patogenesi le interazioni geni-ambiente giocano un ruolo dominante.  Questi disordini, considerati insieme, affliggono il 5% circa della popolazione.  E’ degno di nota, come risultato di meccanismi fisiopatologici comuni, che i pazienti affetti da una malattia autoimmune hanno una suscettibilità aumentata ad altre condizioni autoimmuni.

            L’incidenza di autoimmunità è in accrescimento in tutto il mondo.  Le anormalità immunologiche possono precedere di mesi o anni i sintomi iniziali e la diagnosi clinica e, con i fattori genetici di rischio, sono rilevanti per le strategie predittive della malattia.

            Studi sperimentali dimostrano che l’autoimmunità deriva dall’evasione dal timo delle cellule T autoreattive specifiche per l’antigene verso la periferia durante l’età perinatale.  Ciò è causato dalla mancanza nell’espressione timica promiscua di antigeni periferici specifici d’organo nello stesso organo.  Tra gli attori cellulari, le cellule T helper (Th), che hanno evaso i meccanismi di auto-tolleranza, iniziano l’infiammazione e forniscono l’help a cellule B autoreattive attraverso la mediazione di citochine pro-infiammatorie.  L’attivazione, espansione e successiva differenziazione delle cellule B mature in plasmacellule che producono autoanticorpi contribuiscono ulteriormente al danno tessutale.  Le cellule Th, quando incontrano l’auto-antigene o l’antigene con reattività crociata, si attivano, si espandono e differenziano nei sottotipi Th1 e Th2, T regolatorie (Treg) e cellule Tr1.  Le cellule Th1 e Th2 secernono due diverse vie citochiniche mutualmente inibitorie.  Le cellule Th1 secernono interleuchina 2 (IL-2) ed interferone gamma (IFN-γ), mentre le cellule Th2 secernono interleuchina 4 (IL-4), interleuchina 5 (IL-5) ed interleuchina 10 (IL-10).  Recentemente è stato mostrato che il sottotipo di cellule T CD4+ Th17 hanno un ruolo critico nella patogenesi dell’artrite reumatoide (RA) e della sclerosi multipla (MS).  Queste cellule producono interleuchina 17 (IL-17), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleuchina 6 (IL-6) e granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).  Le cellule B regolatorie che esprimono CD5, un regolatore negativo del segnale del recettore delle cellule T (TCR) e del recettore delle cellule B (BCR), proteggono contro l’autoimmunità attraverso la produzione di IL-10.  E’ stato visto che le cellule B CD5, chiamate cellule B1, esprimono IgM in quantità più elevate delle IgG.  Le IgM sono innalzate in varie condizioni autoimmuni, anche se non è chiaro se questi anticorpi abbiano un ruolo nella perdita della tolleranza immunologica o se rappresentino semplicemente un epifenomeno.

            Le informazioni riguardanti l’eziopatogenesi e la suscettibilità genetica all’autoimmunità sono aumentate rapidamente con gli avanzamenti in immunogenetica degli ultimi anni.  Come è stato recentemente mostrato attraverso studi di mappatura genica, loci genetici multipli sono responsabili di T1D, lupus eritematoso sistemico (SLE), MS, malattia infiammatoria dell’intestino (IBD), RA e psoriasi.

            Nelle malattie autoimmuni caratterizzate dal coinvolgimento di molteplici sottotipi, una associazione di alleli genetici comuni è stata dimostrata per la prima volta negli anni 1970 con la regione del complesso maggiore d’istocompatibilità (MHC) che codifica per gli antigeni leucocitari umani (HLA).  Con l’avvento di studi di genome-wide linkage, candidate gene, e genome-wide association, oltre all’HLA, sono stati scoperti molti polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) che sono sospettati di essere alla base della patogenesi dell’autoimmunità.  Citando esempi di geni candidati di suscettibilità comune coinvolti nella regolazione immune, cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) sopprime l’attivazione delle cellule T, forkhead box protein 3 (FoxP3) è coinvolto nella differenziazione Treg, anche il gene IL-2Rα/CD25 influenza lo sviluppo e la funzione Treg, ed il gene TNF-α, localizzato sul cromosoma 6p21.3, è alla base del rischio aumentato dell’associazione T1D e malattia autoimmune della tiroide.  Tra gli altri, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 (PTPN22) che codifica per la proteina lymphoid tyrosine phosphatase (Lyp) influenza la via di segnale del TCR.

            Negli ultimi anni sono state scoperte nuove molecole e vie con funzioni cardinali nella regolazione della tolleranza immunologica e dell’autoimmunità.  In questa rassegna, ci focalizziamo sul ruolo fisiologico esercitato dal recettore programmed cell death 1 (PD-1, CD279) e dai suoi ligandi [PD-L1 (B7-H1; CD274) e PD-L2 (B7-DC; CD273)] nella regolazione dell’attivazione delle cellule T, tolleranza e danno d’organo mediato dall’autoimmunità.  Questa via esercita funzioni inibitorie nelle infezioni virali croniche, tumori, con una rilevanza particolare nell’autoimmunità.  E’ stato trovato che sia PD-1 che PD-L1 sono espressi non solo sulle cellule T, ma anche sulle cellule B, macrofagi, ed alcuni tipi di cellule dendritiche (DC).  Le dinamiche della via PD-1 e Treg è stata delucidata in particolare nello spiegare le sue funzioni inibitorie.  Quindi, la via può esercitare delle potenziali interazioni immunologiche.  E’ stato riportato che la sua funzione alterata in modelli sperimentali di autoimmunità e polimorfismi patogenetici è stata già identificata in molte condizioni umane autoimmuni, in alcuni gruppi etnici.  Infine, discuteremo le possibili applicazioni cliniche della manipolazione di PD1-PD-L1 in autoimmunità.

  1. Il ruolo fisiologico di PD-1 nell’attivazione linfocitaria

            L’attivazione delle cellule T è indotta in seguito all’interazione del TCR con il peptide/MHC specifico; i segnali co-stimolatori avvengono attraverso recettori presenti sulla superficie delle cellule T che interagiscono con i loro ligandi selettivi sulle cellule che presentano l’antigene (APC).  Quando non viene ingaggiata la co-stimolazione ed il segnale avviene solo attraverso il TCR, è indotto uno stato di anergia o di apoptosi.

            Tra i recettori co-stimolatori, sono state ampiamente investigate molecole che appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline (Ig) come CD28 che si lega al ligando B7-1 o B7-2 ed il co-stimolatore inducibile (ICOS), che ha come bersaglio il ligando di ICOS (ICOS-L).  Accanto a questi segnali co-attivatori, dei recettori co-stimolatori inibitori promuovono stimoli negativi; il loro equilibrio influenza l’attivazione delle cellule T ed il mantenimento della tolleranza periferica.  Quando questo equilibrio è alterato, possono insorgere condizioni autoimmuni.

            CTLA-4 ed il recettore PD-1, scoperto recentemente, costituiscono recettori co-stimolatori negativi.

            PD-1 è stato inizialmente isolato nel 1992 dal gruppo di Ishida da un ibridoma murino a cellule T che andava incontro a morte cellulare programmata.  Il PD-1 umano appartiene alla superfamiglia Ig e rappresenta l’omologo del PD-1 murino (mPD-1).  La proteina del PD-1 umano è un monomero della superficie cellulare, costituito da 288 amminoacidi che mostrano il 60% di identità con il mPD-1.  L’espressione dell’mRNA del PD-1 correla con l’apoptosi indotta dall’attivaziobe negli ibridomi murini a cellule T.  Tuttavia, il legame di PD-1 non promuove morte cellulare, ma induce un blocco del ciclo cellulare.

2.1 Struttura molecolare ed espressione del PD-1 e dei suoi ligandi

            PD-1 è una glicoproteina, caratterizzata da un dominio tipo Ig tipo variabile (V-type) all’estremità n-terminale extracellulare, un dominio trans-membrana ed un dominio citoplasmatico, che contiene un immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) ed un immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)(Fig. 1).

Figura 1. Effetti della via PD-1/PD-L1 sul segnale del TCR. L’attivazione della cellula T è indotta in seguito all’interazione del TCR con il peptide/MHC specifico; il segnale co-stimolatorio del CD28 avviene attraverso i recettori presenti sulla superficie della cellula T che interagiscono con i ligandi selettivi sulle APC. Il legame co-stimolatorio negativo del PD-1 da parte del PD-L1 o del PD-L2 causa la fosforilazione dell’ITIM e ITSM nel dominio citoplasmatico di PD-1 ed il reclutamento di SHP-1 e SHP-2. SHP-1 ed SHP-2 bloccano la fosforilazione di Akt inibendo a monte il suo attivatore PI3K indotto da CD28. La via di segnale di PD-1 ha come bersaglio anche ZAP-70. L’interazione PD-1/PD-L1 riduce la sintesi di citochine e il metabolismo del glucosio, blocca la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule T. Quest’ultimo effetto è promosso direttamente, attraverso il blocco dell’attivazione mediata da CD28 ed indirettamente agendo sulla secrezione di IL-2. Inoltre il fattore di sopravvivenza cellulare Bcl-xL è inibito. La stimolazione di CTLA-4 sopprime Akt attraverso l’attivazione di PP2A, con un effetto inibitorio più basso, (indicato dalle freccie nere sottili) della via di segnale del PD-1 (indicata dalle freccie nere più spesse). CTLA-4 non esercita alcun effetto su PI3K. L’interazione PD-1/PD-L1 rappresenta un inibitore degli effetti attivatori indotti dal TCR più potente del CTLA-4 attraverso il blocco di un numero maggiore di segnali prossimali alla membrana e quindi esercitando una inibizione più ampia dell’attivazione delle cellule T.

Figura 1. Effetti della via PD-1/PD-L1 sul segnale del TCR. L’attivazione della cellula T è indotta in seguito all’interazione del TCR con il peptide/MHC specifico; il segnale co-stimolatorio del CD28 avviene attraverso i recettori presenti sulla superficie della cellula T che interagiscono con i ligandi selettivi sulle APC. Il legame co-stimolatorio negativo del PD-1 da parte del PD-L1 o del PD-L2 causa la fosforilazione dell’ITIM e ITSM nel dominio citoplasmatico di PD-1 ed il reclutamento di SHP-1 e SHP-2. SHP-1 ed SHP-2 bloccano la fosforilazione di Akt inibendo a monte il suo attivatore PI3K indotto da CD28. La via di segnale di PD-1 ha come bersaglio anche ZAP-70. L’interazione PD-1/PD-L1 riduce la sintesi di citochine e il metabolismo del glucosio, blocca la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule T. Quest’ultimo effetto è promosso direttamente, attraverso il blocco dell’attivazione mediata da CD28 ed indirettamente agendo sulla secrezione di IL-2. Inoltre il fattore di sopravvivenza cellulare Bcl-xL è inibito. La stimolazione di CTLA-4 sopprime Akt attraverso l’attivazione di PP2A, con un effetto inibitorio più basso, (indicato dalle freccie nere sottili) della via di segnale del PD-1 (indicata dalle freccie nere più spesse). CTLA-4 non esercita alcun effetto su PI3K. L’interazione PD-1/PD-L1 rappresenta un inibitore degli effetti attivatori indotti dal TCR più potente del CTLA-4 attraverso il blocco di un numero maggiore di segnali prossimali alla membrana e quindi esercitando una inibizione più ampia dell’attivazione delle cellule T.

Il motivo ITSM gioca un ruolo critico per l’attività PD-1 in quanto ciò correla con l’ingaggio delle fosfatasi SHP-1 e SHP-2 (Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase 1 e 2), anche se in condizioni normali non si sa se c’è il coinvolgimento di una o di entrambe le SHP.

            PD-1 è espresso durante lo sviluppo timico, più specificamente su timociti immaturi CD4CD8 durante il riarrangiamento del TCR β.  PD-1 è espresso anche da una piccola frazione di timociti, cellule spleniche, linfonodali e di midollo osseo murino.  Molti fattori possono indurre l’espressione di PD-1.  I livelli dell’mRNA di PD-1 sono raramente presenti in cellule T umane primarie non stimolate e fino a 24 ore di stimolazione.  E’ stato trovato un picco di espressione solo dopo 48 ore di stimolazione con CD3/CD28 rivestite con palline.

            Esperimenti in vitro hanno dimostrato che la concanavalina A (con A) o il phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA)/ionomicina sono capaci di promuovere PD-1 su timociti murini e cellule T spleniche, mentre gli anticorpi anti-IgM e la PMA/ionomicina promuovono PD-1 nelle cellule B spleniche.  Il trattamento con anti-CD3 produceva lo stesso effetto anche sui timociti e sulle cellule T nella milza e nei linfonodi in vivo in topi C57BL/6.  In accordo con precedenti osservazioni che dimostravano l’aumentata espressione di PD-1 in seguito a stimolazione del TCR, solo l’1% degli splenociti in riposo, ottenuti da topi NOD e BALB/c, mostravano espressione di PD-1, e questa percentuale aumentava dopo 48-72 ore di stimolazione con anti-CD3.  Quindi, il segnale del BCR e del TCR e le citochine possono indurre l’espressione di PD-1 sui linfociti T; in aggiunta, è stata riportata l’aumentata espressione di PD-1 sui linfociti T e le APC come conseguenza della stimolazione estrogenica.

            PD-1 si lega a PD-L1 (B7-H1; CD274) e PD-L2 (B7-DC; CD273) con diversa affinità.  PD-L2 è tre volte più potente di PD-L1 nel legare PD-1.

            L’espressione di PD-L1 è più ampia rispetto a PD-L2.  L’espressione costitutiva di PD-L1 è più elevata nei topi rispetto all’uomo.  PD-L1 è costitutivamente espresso in cellule staminali mesenchimali, T, B, DC, e macrofagi murini e su mast-cellule in coltura derivati da midollo osseo (BM) e la sua espressione è aumentata in caso di loro attivazione.  PD-L1 è espresso anche in cellule non-ematopoietiche, tra cui cellule pancreatiche, epiteliali, endoteliali vascolari, muscolari, epatocitarie ed astrociti oltre alla sua espressione nell’occhio, polmoni, rene, milza, timo, in particolare sia nel tessuto corticale che midollare del timo fetale umano.  PD-1 è altamente espresso nell’endotelio cardiaco fetale e nel sincizio trofoblasto della placenta umana; è riportata un’espressione bassa nel citotrofoblasto e nel miocardio fetale.  Nel cuore dell’adulto si osservano livelli opposti di espressione di PD-1; sono alti nel miocardio e bassi nelle cellule endoteliali.

            L’espressione di PD-L2 è limitata alla regione midollare del timo e, a bassi livelli, nel miocardio fetale e nelle cellule endoteliali; non è rilevabile nel trofoblasto, mentre è fortemente espresso nelle cellule endoteliali della placenta.  L’espressione di PD-L2 può essere indotta in diversi tipi cellulari, come le cellule DC, le cellule B peritoneali B1, macrofagi, mastcellule derivate dal BM e cellule B della memoria.

            Linfociti T umani CD4+ e CD8+ non stimolati non mostrano espressione di PD-L1 e PD-L2; tuttavia, PD-L1 veniva indotto in seguito ad attivazione sia di cellule CD4+ che CD8+, mentre è stata riportata un’espressione molto bassa di PD-L2 in seguito a stimolazione di linfociti CD8+ ma non in linfociti T CD4+.

            Il legame concomitante di PD-1 a PD-L1 o PD-L2 durante l’attivazione del TCR induce il blocco della proliferazione delle cellule B e T, secrezione di citochine, inibizione delle funzioni citotossiche ed influenza la sopravvivenza delle cellule T.  Quest’ultimo effetto e l’effetto inibitorio sulle funzioni delle cellule T può avvenire sia direttamente agendo sui segnali attivatori precoci indotti da CD28 che indirettamente sulla secrezione di IL-2.

2.2 La via PD-1-PD-L nell’attivazione dei linfociti T

            Durante l’attivazione delle cellule T, la costimolazione CD3/CD28 induce molti segnali intracellulari, che influenzano il metabolismo e la divisione cellulare.  Il CD28 ingaggia ed attiva il phasphatidylinositol 3-kinase (PI3K) che promuove l’attivazione della protein kinase B (Akt).  La via di attivazione PI3K/Akt aumenta la captazione di glucosio, attraverso l’aumento dell’espressione di Glut1 e del metabolismo nelle cellule T; ciò consente la loro proliferazione e la secrezione di citochine.

            La cascata di attivazione, che porta infine alla fosforilazione di Akt, non è stata completamente delucidata (Fig. 1).

In conseguenza della stimolazione dei linfociti T, PD-1 inibisce la fosforilazione di Akt interferendo con l’attivazione di PI3K mediata da CD28, causando la riduzione della sintesi di citochine, ed il blocco della proliferazione e sopravvivenza delle cellule T. Quest’ultimo effetto potrebbe essere dovuto all’azione esercitata sia direttamente, attraverso il blocco di segnali attivatori indotti dal CD28, che indirettamente sulla secrezione di IL-2.  Inoltre, PD-1 inibisce il fattore di sopravvivenza cellulare Bcl-xL.  Altre molecole sono dei bersagli conseguenti al legame di PD-1 al suo ligando.  PD-1 diminuisce la fosforilazione di zeta-chain associated protein 70 kDa (ZAP-70) e di protein kinase ϴ (PKϴ) ed inibisce l’attivazione di extracellular receptor-activated kinase (Erk).

            Sia PD-1 che CTLA-4 riducono l’attivazione di Akt, ma hanno come bersaglio molecole diverse, diminuendo la capacità delle cellule T di introdurre e metabolizzare il glucosio, come dimostra la riduzione della captazione di glucosio e del ritmo glicolitico dopo il loro ingaggio.  Nonostante ciò, soprattutto il legame del PD-1, in paragone al legame di CTLA-4, riduce l’espressione di Bcl-xL indotta dalla co-stimolazione di CD28, a livelli simili a quelli che si hanno in seguito a trattamento di linfociti T CD4 attivati con LY294002, un inibitore di PI3K.  PD-1 e CTLA-4 inibiscono l’attivazione delle cellule T usando meccanismi diversi.  PD-1, agendo direttamente su PI3K, potrebbe esercitare un effetto inibitorio più ampio rispetto a CTLA-4.  Quest’ultimo regola negativamente l’attivazione delle cellule T inibendo la fosforilazione di Akt che avviene attraverso l’attivazione di protein phosphatase 2 (PP2A).  CTLA-4 non esercita alcun effetto su PI3K.

            L’analisi di espressione genica dei profili trascrizionali promossi da palline rivestite con CD3/CD28/CTLA-4 e CD3/CD28/PD-1 in cellule T CD4 umane isolate di fresco, ha confermato il maggiore effetto inibitorio di PD-1 sull’attivazione indotta da CD3/CD28 rispetto a CTLA-4.  Questo fenomeno conferma che gli effetti di PD-1 sui segnali avvengono maggiormente in prossimità della membrana rispetto a CTLA-4 (fig. 1).

            Anche se il blocco sia di PD-1 che di CTLA-4 ha mostrato effetti inibitori sull’induzione della tolleranza delle cellule T CD4+ periferiche, solo la via PD-1, più in dettaglio l’interazione PD-1/PD-L1, differentemente dalle vie inibitorie di PD-L2 e CTLA-4, è implicata nel mantenimento della tolleranza periferica.  Infatti, il blocco PD-L1 era capace di abrogare la tolleranza mediata da anti-CD3 in topi non obesi diabetici (NOD) anche per settimane dopo la sua induzione e di promuovere il diabete, mentre il gruppo di controllo, che riceveva solo il trattamento con anti-CD3, rimaneva euglicemico per l’intero periodo di studio.  In accordo con questi dati, dimostrando il coinvolgimento della via PD-1 sia nella tolleranza specifica per l’antigene che in quella indotta da anti-CD3, il trattamento con anti-CD3 non era in grado di prevenire lo sviluppo di diabete nei topi NOD senza PD-1 (knock-out, KO).

            Sia CTLA-4 che PD-1 restringono il segnale delle cellule T , il rilascio di citochine e la progressione del ciclo cellulare, ma la loro inibizione induce effetti qualitativi e quantitativi differenti (vedi dopo).  PD-1 o Il blocco PD-L1 inibiscono la motilità delle cellule T nelle isole pancreatiche, restaurano interazioni stabili cellule T-DC ed aumentano la produzione di citochine dalle cellule T.  Gli anti-PD-L1 inducono la fosforilazione di Erk in cellule T tollerizzate, il che’ costituisce un evento prossimale di segnale, e la produzione di citochine infiammatorie, accelerando così lo sviluppo di diabete.  Al contrario, il blocco CTLA-4 non altera il movimento delle cellule T tollerizzate né influenza la tolleranza.  Come conseguenza dei diversi meccanismi utilizzati, la diminuzione di CTLA-4 causa una rapida infiammazione tessutale che colpisce molti organi e la morte dei topi in 3-4 settimane indipendentemente dal ceppo dei topi, mentre la deficienza di PD-1 non promuove un così rapido sviluppo di autoimmunità in accordo al substrato genetico del topo.

            Come già riportato, gli effetti soppressivi di PD-1 sono mediati da fattori che si legano al suo motivo ITSM; il reclutamento della fosfatasi SHP-2 sul residuo di Tyr fosforilato in ITSM è in parte responsabile dell’effetto inibitorio esercitato da PD-1 attraverso la defosforilazione delle molecole di segnale che appartengono alle vie del TCR o del BCR.

  1. Segnale di PD-1 e Treg

            E’ degno di nota che PD-1 e PD-L1 sono stati rilevati nelle Treg, caratterizzate dall’espressione di FoxP3.  Le Treg possono essere suddivise in due sottopopolazioni: naturali (nTreg), che si sviluppano nel timo, ed adattive (iTreg), generate in periferia da cellule T naive CD4+FoxP3+.  Esperimenti in vitro dimostrano la conversione di cellule T naive in iTreg in seguito a stimolazione con TGF-β e IL-2.  Le Treg sono coinvolte nella regolazione della tolleranza periferica attraverso l’inibizione delle cellule T effettrici e la soppressione del danno tessutale mediato immunologicamente attraverso molti meccanismi.

            Le Treg FoxP3+ inibiscono la trascrizione di IL-2 e regolano positivamente l’espressione del IL-2R.  Sono stati osservati un elevato assorbimento di IL-2 da parte delle Treg ed una ridotta captazione da cellule T convenzionali vicine.  La conseguente deplezione di IL-2 da parte delle Treg induce apoptosi di cellule T effettrici.

            Si è supposto che anche IL-10, TGF-β e IL-35 possano rappresentare mediatori critici per l’attività inibitoria delle Treg.

            Altri meccanismi usati dalle Treg FoxP3+ per diminuire la risposta immunologica sono la riduzione del tempo di interazione che si stabilisce tra DC ed effettori T (limitando la stimolazione delle cellule T da parte delle DC), la diminuita espressione di molecole co-stimolatorie in DC sia umane che murine e la citolisi delle cellule effettrici T, delle APC e delle cellule NK.

            L’interazione tra PD-1 e PD-L1 può influenzare la generazione delle Treg, le proprietà delle Treg soppressorie ed anche l’interazione tra Treg e cellule T effettrici.

            Amarnath e coll. hanno dimostrato  che il ruolo protettivo mediato da PD-L1 sulle cellule Treg umane nel prevenire la graft-vs-host disease xenogenica (xGVHD) mortale uomo-verso-topo, una patologia mediata da cellule Th1.  Uno studio successivo, nello stesso modello animale, ha mostrato recentemente che non solo le Treg, ma anche le cellule effettrici che esprimono PD-L1 prevengono completamente la letalità di xGVHD con un effetto protettivo a lungo termine.  Inoltre, attraverso un monitoraggio di 25 ore sul destino delle Th1 dopo il trapianto, le cellule T PD-L1 LV-trasdotte inibivano la produzione di IFN-γ tramite cellule Th1 ed inducevano l’aumento di cellule Th1 che esprimono FoxP3 e non rilasciano IFN-γ.

            Le cellule Th1 mostrano plasticità differenziativa e la loro conversione nelle Treg è un meccanismo dipendente da PD-L1, come è dimostrato dall’osservazione che sia l’inibizione di PD-1 con siRNA anti-PD-1 o l’inibizione farmacologica del segnale SHP1/2, mantengono il fenotipo effettore delle cellule T, prevenendo la loro conversione a Treg.

            Alterazioni nella frequenza di Treg ha causato lo sviluppo di condizioni autoimmuni.  Inoltre le funzioni soppressorie Treg vengono modulate da PD-1, come è dimostrato dall’inibizione dello sviluppo di colite da parte di Treg che esprimono PD-1.

  1. Ruolo della via PD-1/PD-L1 nell’insorgenza e mantenimento della tolleranza

            PD-1 e i suoi ligandi sono coinvolti nella modulazione sia della tolleranza centrale che periferica, anche se sono stati riportati effetti opposti indotti dai ligandi del PD-1, dal momento che alcuni studi supportano l’inibizione della risposta immune, mentre altri il loro ruolo attivatorio.

            In particolare, PD-1 gioca un ruolo critico a molti livelli nello sviluppo timocitario, attraverso la regolazione della soglia di segnale durante la selezione positiva.  Si è visto che come conseguenza della perdita di PD-1 o PD-L1, il numero di timociti DP (CD4+CD8+) era aumentato.

            In aggiunta, PD-1 è coinvolto nella regolazione della selezione negativa.  La proliferazione di cellule T naive autoreattive e la loro differenziazione in cellule T effettrici può essere inibita dall’interazione PD-1/PD-L1; inoltre, l’espressione di PD-L1 e PD-L2 anche sulle DC potrebbe avere un ruolo nel destino delle cellule T, che vanno verso l’attivazione o la tolleranza.  Ancora la via PD-1/PD-L è implicata nella modulazione negativa della riattivazione, espansione ed attività delle cellule T effettrici.

            La via PD-1/PD-L gioca un ruolo critico nella tolleranza tessutale.  A riguardo, il paragone di topi deficienti per PD-L1 (PD-L1-/-) o per PD-L2 (PD-L2-/-) con i topi deficienti di entrambi i ligandi (PD-L1/L2-/-) hanno dimostrato che, anche se i ligandi PD giocano ruoli sovrapponibili nella regolazione negativa della risposta immune, PD-L1 ha un effetto unico nel sopprimere la funzione delle cellule T autoreattive, proteggendo così le isole pancreatiche dalla loro distruzione.  In accordo a ciò, il trattamento dei topi NOD con anticorpi PD-L1 o PD-1 accelera lo sviluppo del diabete.

            Il ruolo della via PD-1/PD-L nel mantenimento della tolleranza tessutale, è suggerita anche dalla rilevazione dell’espressione di PD-L1 sia sulle cellule ematopoietiche che non ematopoietiche.  E’ stata avanzata l’ipotesi che l’espressione di PD-L1 sulle cellule endoteliali possa limitare la extravasazione di cellule T nei tessuti.

4.1 La via PD-1/PD-L1 e la tolleranza nei siti immunologicamente privilegiati

            L’espressione di PD-L1 è stata osservata anche in siti immunologicamente privilegiati, come l’occhio e la placenta, dove l’espressione di PD-L1 è aumentata dal quarto mese di gestazione.

            Nell’occhio è stata trovata un’espressione costitutiva di PD-L1, ma non di PD-L2.  E’ stata riportata l’espressione di PD-1 nella cornea, nell’iride-corpo ciliare e retina.  Il ruolo della via di segnale PD-1/PD-L1 nella protezione di questo sito dalla risposta immune, causata dalle cellule T attivate, è stata confermata dall’osservazione che il trattamento con anticorpi anti-PD-1 o PD-L1, ma non PD-L2, promuove il rigetto di allo-trapianto della cornea.  All’opposto, la sopravvivenza dell’allotrapianto corneale si prolunga in vivo in seguito a trattamento con una proteina di fusione PD-L1-immunoglobulina.

            L’interazione tra PD-1/PD-L1 può essere coinvolta nello sviluppo della tolleranza materno-fetale, dal momento che il trattamento con anticorpi anti-PD-L1, ma non anti-PD-L2, aumenta il numero di aborti di feti allogenici che promuovono l’invasione di cellule T nella placenta.

            Un lavoro recente ha dimostrato l’aumento del riassorbimento e della riduzione embrionale nel numero della prole in seguito a blocco di PD-L1, attraverso l’iniezione intraperitoneale di anticorpi monoclonali (mAb) verso PD-L1 (MIH6) in topi femmine B6 Thy1.1 gravide, in associazione con una diminuzione locale dell’espressione, nell’interfaccia materno fetale, dell’espressione genica di FoxP3 e ICOS e diminuzione del numero delle Treg.

  1. Studi sul PD-1 in modelli sperimentali animali di autoimmunità

            Il ruolo della via PD-1/PD-L1 in autoimmunità è stata investigata in modelli sperimentali animali di malattia inclusi T1D, SLE, miocardite autoimmune, encefalomielite autoimmune (EAE), RA, enteropatie come viene riassunto di seguito.

5.1 Diabete tipo 1

            Il T1D è una malattia autoimmune poligenica, che insorge in individui geneticamente predisposti per l’HLA come conseguenza di una distruzione immune specifica d’organo delle cellule β che producono insulina nelle isole di Langherans all’interno del pancreas.  L’espansione di cellule T autoreattive CD4+ e CD8+, dei linfociti B che producono autoanticorpi e l’attivazione del sistema immune innato caratterizza la rottura della tolleranza immune nella patogenesi della malattia.  Il modello del topo NOD, che sviluppa spontaneamente la malattia, ricordando strettamente il T1D umano, ha grandemente aiutato nella comprensione dei meccanismi molecolari eziopatogenetici ed in particolare nel ruolo di entrambe le vie PD-1/PD-L1.

            I topi NOD sono caratterizzati da una bassa espressione sia di PD-L1 che di PD-L2 negli organi linfoidi in paragone ai topi resistenti al diabete.  Più in dettaglio, è stata riportata l’espressione di PD-L1 nelle isole pancreatiche, endotelio vascolare, cellule linfoidi e APC nei topi NOD, mentre l’espressione di PD-L2 è stata trovata su APC attivate.  L’espressione di PD-L1 in cellule linfoidi può limitare le fasi più precoci della malattia, mentre l’aumentata espressione di PD-L1 nelle cellule β, osservata durante il processo di insulite, potrebbe restringere gli eventi patogeni tardivi all’interno del pancreas.  Nonostante con l’età aumentino PD-1 e PD-L nei topi NOD, il diabete si sviluppa, il chè suggerisce un ruolo difettivo di questa via di segnale nel bloccare la progressione della malattia.

            Una delle prime evidenze per l’effetto protettivo di PD-L1 nel T1D è stata fornita da Ansari et al., anticorpi bloccanti verso il PD-1 (J43) o PD-L1 (MIH6), quando vengono somministrati a topi NOD, accelerano fortemente lo sviluppo del diabete.  Un effetto simile sulla malattia si ottiene nel modello RIP-OVA di trasferimento di tolleranza periferica con anticorpi bloccanti verso PD-1 e PD-L1.  La rimozione di linfonodi pancreatici diminuisce fortemente la frequenza del diabete solo in topi NOD più giovani (topi di 3 settimane), anche se vengono iniettati con mAb anti PD-L1 (il cui effetto è la precipitazione del diabete).  Invece, la rimozione dei linfonodi pancreatici era inefficace nel ridurre l’incidenza di diabete, quando topi più vecchi (topi di 11 settimane), che avevano una insulite evidente, ricevevano il blocco di PD-L1.

            Wang et al., hanno identificato i tipi cellulari che esprimono PD-L1 nei topi NOD normali [wild type (WT)]: le cellule alpha mostravano una modesta espressione di PD-L1, le cellule beta e DC mostravano una forte espressione, mentre i linfociti T e B non esprimevano la molecola.  In particolare, l’espressione pancreatica di PD-L1 era pronunciata nell’area di confine, supportando l’idea che PD-L1 espresso nelle cellule beta potrebbe inibire le cellule T che esprimono PD-1, limitando così la loro residenza pancreatica.

            In aggiunta, la deficienza di PD-1 o PD-L1 induceva accelerazione nello sviluppo e frequenza del diabete nei topi NOD, associata con una infiltrazione prevalente di cellule Th1 nelle isole pancreatiche e ad un numero più elevato di splenociti reattivi alla decarbossilasi dell’acido glutammico (GAD) che rilasciano IFN-γ.  Topi deficienti di PD-1 non mostrano nessuna differenza nel titolo di autoanticorpi verso l’insulina e nel numero di cellule Treg CD4+CD25+ in paragone con topi NOD WT.  L’aumentata residenza di cellule T CD4+ nel pancreas è stata recentemente correlata con una più alta espressione di CXCR3, che media il traffico di cellule Th1 effettrici.

            Il ruolo protettivo esercitato dalla via di segnale del PD-1 è stata valutata in un modello murino con aumentata espressione di PD-L1: i topi NOD transgenici per PD-L1 (L1C).  Questo ceppo mostrava una significativa riduzione della gravità dell’insulite ed un ritardo nello sviluppo del diabete, associato ad una riduzione dell’incidenza di diabete spontaneo.  All’opposto, l’aumentata espressione di PD-L1 causa la promozione del diabete nelle isole di topi C57BL/6.

            L’aumentata espressione di PD-L1 in topi L1C era protettiva anche in caso di diabete indotto dal trasferimento di linfociti patogenici.  Tuttavia, il trapianto di isole pancreatiche transgeniche da topi L1C in topi NOD diabetici non evitava la ricorrenza del diabete, ma prolungava solo parzialmente la sopravvivenza delle isole transgeniche.

5.2 Lupus eritematoso sistemico

            Il SLE è una malattia sistemica autoimmune, dove le alterazioni specifiche del tessuto sono dovute alla produzione di anticorpi anti-nucleari dipendenti da cellule T, con deposizione di complessi immuni, espressione di chemochine e produzione di citochine da linfociti T attivati.

            Lo studio dei topi PD-1-/- ha messo in luce il ruolo della via PD-1/PD-L nel mantenimento della tolleranza delle cellule T e la sua funzione come regolatore negativo dell’autoimmunità.  Nei vari ceppi di topo con baso PD-1 si producono effetti diversi.  In dettaglio, topi C57BL/6 deficienti per PD-1 sviluppano una glomerulonefrite ed una artrite proliferativa autoimmune simile al lupus caratterizzate da deposizione di IgG3 e complemento C3 nei glomeruli.

            Questi ultimi dati sono in accordo con precedenti osservazioni di un aumento selettivo di IgG3 nel siero associato con aumentata produzione di IgG3 dopo stimolazione con antigene TI-2 in topi B6-PD-1-/-.  Al contrario, alla stessa età, topi C57BL/6-PD-1+/+ mostrano segni di artrite e solo marginali lesioni glomerulari legati all’età.

5.3 Miocardite

            La deficienza di PD-1 causa lo sviluppo di cardiomiopatia dilatativa autoimmune grave ed insufficienza cardiaca in topi BALB/c.  La patologia è caratterizzata dalla presenza di autoanticorpi che riconoscono la troponina I cardiaca.  Nei topi MRL, la deficienza di PD-1 causa una forte infiltrazione di cellule mieloidi; le cellule CD4+ e CD8+ nel cuore sono correlati ad alti livelli di autoanticorpi contro la miosina cardiaca.  I topi muoiono per miocardite fatale.  Inoltre, la diminuzione di PD-1 causa lo sviluppo di miocardite autoimmune e la concomitante presenza di polmonite in questo ceppo di topi.

            Più recentemente due modelli di miocardite mediata da cellule T sono stati usati per valutare il ruolo della via PD-1/PD-L.  Cellule T CD8 PD-1-/- promuovono la malattia, aumentando l’infiltrato infiammatorio, in paragone alle cellule T CD8 PD-1+/+.  E’ da notare che cellule T deficienti di PD-1 mostrano aumentata proliferazione e sono altamente citotossiche contro l’endotelio miocardico in vitro.  I topi che non hanno PD-1 sviluppano una malattia più grave dei topi WT affetti da miocardite autoimmune dipendente da cellule T CD4+.  Questi animali mostrano un livello più alto di infiammazione miocardica, inclusi i linfociti T CD8+.

5.4. Encefalomielite autoimmune

            EAE è un modello animale di MS la cui eziologia rimane sconosciuta.  La malattia è caratterizzata dalla distruzione della mielina e degli assoni nel sistema nervoso centrale (CNS) da parte di cellule T autoreattive capaci di passare attraverso la barriera emato-encefalica (BBB).

            E’ stato valutato il ruolo del PD-1 nella regolazione della tolleranza immune nell’EAE.  Nonostante gli studi di Salama et al., abbiano riportato un ruolo critico di entrambi i ligandi PD-1 nella patogenesi dell’EAE, studi successivi hanno dimostrato che l’interazione PD-1/PD-L1, e non quella PD-1/PD-L2, può regolare la gravità dell’EAE.  Inoltre, la perdita di PD-L1 causava l’inizio di questa patologia anche in ceppi di topi resistenti all’EAE.

            La generazione di Treg si otteneva da cellule T naive specifiche per il peptide MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein)-35-55 in presenza di DC e TGF-β; il fenomeno era dipendente da PD-1.  Lo studio successivo di Yogev et al., ha confermato che le DC sono fondamentali nel promuovere l’aumentata espressione di PD-1 in cellule T specifiche per l’antigene e la generazione di Treg.  In accordo a ciò, le alterazioni del numero delle DC influenzava la tolleranza ed induceva una risposta infiammatoria grave.

            Wang et al., ha confermato che il livello dell’espressione di PD-1 costituisce un passaggio fondamentale nella regolazione dell’immunità e nel mantenimento della tolleranza, dimostrando che le Treg ottenute dai topi geneticamente senza PD-1 erano meno soppressive di quelle da topi WT.

            Tuttavia, PD-1 non esercitava alcuna influenza su cellule T autoreattive attivate dalla mielina, come dimostrato dallo sviluppo dell’EAE di uguale gravità  in topi naive geneticamente senza PD-1 e nei topi WT che ricevevano entrambi cellule T attivate in vitro con peptide MOG-35-55.  La deficienza di PD-1 consentiva lo sviluppo di EAE in topi geneticamente senza PD-1, anche se non venivano immunizzati con tossina della pertosse (PTX); la patologia si sviluppava con una gravità simile a quella di topi WT che ricevevano PTX.  E’ stato ipotizzato che PTX potrebbe incrementare l’induzione di EAE tramite la diminuita espressione di PD-1 in cellule T CD4+FoxP3+ in topi WT.  In generale la capacità di PTX di diminuire l’espressione di PD-1 nelle Treg, influenzando indirettamente la loro funzione e la loro frequenza, potrebbe sostenere l’ipotesi che le infezioni, come evento stressante, possano giocare un ruolo nell’induzione della patogenesi della MS da parte di cellule T reattive alla mielina che sono rilevabili, non dannose, ed anche nei controlli sani.

5.5 Enteropatia autoimmune

            La malattia infiammatoria dell’intestino (IBD) si riferisce principalmente a due condizioni autoimmuni croniche che influenzano il tratto gastrointestinale nella malattia di Crohn (CD) e solo il colon nella colite ulcerativa (UC).  Questi disordini sono diagnosticati in circa 1 milione di persone negli USA e 2 milioni di persone in Europa.  Entrambe le malattie sono caratterizzate da infiammazione della mucosa, diarrea, perdita di peso e dolore addominale.  L’IBD può risultare da una risposta immune anormale agli antigeni derivati dai batteri intestinali.  Quindi si verifica l’attivazione dei macrofagi della lamina propria e delle cellule T che porta al perpetuarsi dell’infiammazione con aumentata secrezione di citochine pro-infiammatorie come IL-1β e TNF-α.

            PD-L1 è stato trovato altamente espresso nelle cellule epiteliali intestinali di pazienti IBD in paragone ai controlli sani.  Questo indica il suo potenziale coinvolgimento nella tolleranza mucosale.

            In modelli murini di colite è stata isolata una sottopolazione di cellule T CD4+CD25 PD-1+ , il chè sostiene il ruolo regolatorio della via PD-1/PD-L1.  L’espressione di PD-1 in cellule non colitogeniche derivate dalla milza di topi naive solleva la possibilità che cellule T PD-1+ possano riconoscere il PD-L1, generando così una sottopopolazione di Treg.  Quando cellule T CD4+CD25PD-1+ venivano iniettate in topi con immunodeficienza combinata severa (SCID), che avevano ricevuto cellule T effettrici CD4+CD45RBhigh, la colite veniva soppressa.

            Il coinvolgimento della via PD-1/PD-L1 è stata valutata anche nella regolazione delle risposte delle cellule T CD8+ nel piccolo intestino usando il modello murino transgenico iFABP-tOVA in cui cellule epiteliali intestinali (IEC) mature esprimono una forma corta di OVA (tOVA136-336) come auto-antigene.  E’ stato dimostrato che cellule T CD8+ OT-I TCR, che riconoscono il complesso formato dal peptide OVA (OVA257-264) con molecole HLA di classe I, quando vengono trasferite adottivamente in topi iFABP-tOVA, anche se proliferano e divengono attivate in tutti i linfonodi, vengono deleti.  Invece il trattamento con Ab bloccante per PD-L1 seguito dall’iniezione di cellule T naive CD45.1+ OT-I o il trasferimento di cellule T PD-1-/- OT-I in topi iFABP-tOVA, causa una significativa perdita di peso, una grave enterite e morte.  Le cellule T CD8+ specifiche per OVA si espandono e si differenziano in cellule effettrici secernenti citochine pro-infiammatorie.  La patologia intestinale è simile alla malattia celiaca umana, una malattia autoimmune del piccolo intestino che risulta da una risposta anomala al glutine.

5.6. Artrite reumatoide

            RA è una malattia autoimmune cronica non organo specifica, che colpisce lo 0,5-1% della popolazione generale, e la cui eziologia rimane sconosciuta.  I sintomi più frequenti includono dolore e gonfiore delle articolazioni a causa dell’infiammazione sinoviale, che colpisce piccole articolazioni con limitazione funzionale, anemia, debolezza, aumentato rischio di cardiopatie e osteoporosi.  Il danno selettivo del tessuto sinoviale bersaglio è dovuto parzialmente all’infiltrazione linfocitaria, delle cellule NK, macrofagi, DC, mastcellule e piastrine.  Oltre all’iperplasia dei fibroblasti sinoviali nella sinovia ed aumentata angiogenesi, può intervenire danno alla cartilagine e all’osso.

            Il ruolo delle Treg nella patogenesi della Ra rimane non chiarito.  Nello studio di de Kleer, le Treg regolavano l’infiammazione delle articolazioni di pazienti con la forma remittente della artrite giovanile idiopatica, mentre in altri studi Treg apparivano compromessi in pazienti RA.  Le differenze osservate nei diversi studi sull’uomo potrebbero essere correlate alla popolazione di pazienti investigata.  Raptopoulou et al., hanno trovato che la via inibitoria PD-1/PD-L1 è eccessivamente espressa nella sinovia reumatoide e regola le risposte delle cellule T nella malattia murina e umana.  La collagen II (CII)-induced arthritis (CIA) è un modello murino usato estensivamente per delucidare la patogenesi della RA e scoprire nuovi terapeutici.  L’iniezione intradermica di CII induce gonfiore articolare che porta ad anchilosi e danno cartilagineo articolare.  Wang et al., hanno osservato che il trattamento intraperitoneale di topi con PD-L1Ig antagonizzava lo sviluppo di CIA come documentato dal punteggio clinico dell’artrite e dall’istologia articolare.  PD-L1Ig funziona su cellule attivate aumentando il ritmo di legame, fornendo così effetti più elevati sulla proliferazione cellulare e la produzione di IL.

  1. Polimorfismi del PD-1 ed autoimmunità

            Nell’uomo è stata dimostrata l’associazione di SNP nel gene PD-1 (PDCD1, localizzato sul cromosoma 2q37), in particolare il PD-1.3, PD-1.5 e PD-1.6, con un rischio più elevato di sviluppare malattie autoimmuni gravi.  Questo conferma il possibile coinvolgimento del gene PDCD1 nella regolazione dell’autoimmunità e nel mantenimento della tolleranza.

            Nonostante ciò, è stato riportato anche che non c’è alcuna associazione tra i polimorfismi di PD-1 ed alcune condizioni autoimmuni, in aggiunta all’osservazione di forti differenze nella frequenza degli SNP del PD-1 nei vari gruppi etnici.

            La presenza di SNP del gene PD-1 è stata investigata in 94 bambini ed adolescenti con T1D, diagnosticato prima dei diciotto anni, e 155 controlli selezionati nella popolazione Caucasica Danese.  Sono stati identificati quattordici SNP incluso il polimorfismo intronico PD-1.3 7146G/A.  Ciò è stato riportato nel 12.2% degli individui diabetici contro il 6.8% dei controlli normali, il chè mette in luce un’associazione significativa.  Questo SNP altera un sito di legame per fattori di trascrizione, chiamato Runt-related transcription factor 1 (RUNX1) e conosciuto anche col nome di acute myeloid leukemia 1 protein (AML1); quindi potrebbe agire come un ulteriore allele di suscettibilità a T1D.  Rapporti contrastanti sono stati ottenuti da Asad et al., in una grande coorte di Svedesi attraverso la genotipizzazione di 3 SNP [PD-1 7146 (rs11568821, PD-1.3), PD-1 7785 (rs2227981, PD-1.5), e PD-1 8738 (rs10204525, PD-1.6)].  È stata rilevata una eterogeneità con bassa evidenza per l’intera associazione.

            E’ stato trovato che il polimorfismo intronico PD-1.3 7146G/A è positivamente associato con lo sviluppo di SLE negli Europei del nord, negli Americani Messicani e nella popolazione Greca, mentre i pazienti SLE Spagnoli mostrano una frequenza più bassa di SNP PD-1.3 in paragone ai controlli.  Studi di meta-analisi condotti da Liu et al., hanno confermato una correlazione negativa tra SNP PD-1.3 ed SLE nella popolazione Spagnola ed una associazione positiva con discendenti Europei non Spagnoli.  Il polimorfismo era quasi del tutto assente in Americani Africani, il chè suggerisce una origine recente.

            E’ interessante che lo studio degli effetti PD1.3 SNP sulla trascrizione genica ha mostrato che la condizione eterozigote (G/A) non produce nessuna alterazione dell’espressione dei livelli di PD-1 rispetto alla condizione normale (G/G), mentre una espressione più bassa di PD-1 sulle cellule B CD19+, e sulle cellule T CD4+e CD8+ è stata riportata in 2 pazienti con condizione omozigotica.

            In aggiunta, l’analisi degli effetti di PD1.3 SNP nell’attivazione delle cellule T dimostra che questo SNP influenza le funzioni inibitorie di PD-1.  Infatti, la stimolazione con una concentrazione ottimale di PD-L1.Fc (a 2-5 μg/mL di PD-L1.Fc) induce una forte riduzione della proliferazione delle cellule T (del 70-80%) e della produzione di IFN-γ sia nei controlli che nei soggetti SLE, indipendentemente dal loro genotipo, mentre il trattamento con dosi sub-ottimali di PD-L1.Fc (0.1-0.5 μg/mL PD-L1.Fc) produce una difettiva inibizione mediata da PD-1 della funzione delle cellule T in pazienti SLE PD1.3 A/A.  In particolare, la proliferazione delle cellule T a 48 h era aumentata del 5 + 8 % in pazienti SLE PD1.3 (A/A) omozigoti, mentre era significativamente ridotta in pazienti normali (G/G) ed eterozigoti e nei controlli sani.

            Nessuna correlazione è stata riportata nello studio compiuto da Bertsiaset al., per il polimorfismo PD1.5 (Exon 5, rs222791; alanina   alanina) negli Europei.  Inoltre è stata trovata una correlazione tra PD1.5 ed SLE in pazienti Cinesi.

            RA è stata associata con molti SNP PD-1, anche se risultati opposti sono stati ottenuti a seconda del gruppo etnico analizzato.  Il polimorfismo PD-1.3A/G è stato trovato associato con la RA in pazienti Svedesi negativi per fattore reumatoide e per l’epitopo condiviso.  Nella popolazione Asiatica l’allele T del PD-1.5 C/T è stato trovato associato con la RA in pazienti Cinesi che vivono a Taiwan ma non nei Cinesi di Hong Kong.  In un grande numero di pazienti Giapponesi con RA (n = 1504) e 449 controlli omogenei per sesso, sono stati analizzati 3 SNP (PD-1.1, PD-1.3 e PD-1.5).  Non è stata osservata nessuna associazione significativa dell’RA con i polimorfismi PD-1.1 e PD-1.5.  PD-1.3 non è polimorfico nella popolazione Giapponese.

            Sono stati riportanti risultati controversi anche sull’associazione genetica tra SNP PD-1 e la spondilite anchilosante (AS).  L’AS è una malattia infiammatoria cronica considerata la spondiloartropatia prototipica, insieme all’artrite psoriatica, all’artrite reattiva e all’artrite che complica l’IBD.  Gli uomini sono colpiti 2-3 volte più frequentemente delle donne.  Il disordine è altamente ereditabile (ereditabilità più del 90%) e fortemente associato con HLA-B27 in più del 95% dei soggetti della popolazione Caucasica.  Tuttavia, solo l’1-5% degli individui HLA-B27 positivi sviluppano AS.  Gli altri geni, insieme a fattori ambientali, come le infezioni batteriche, che lavorano di concerto con B27 agiscono nell’iniziare l’AS in soggetti suscettibili.  L’HLA-B27 conta per circa il 37% dell’intero rischio genetico.

            AS è caratterizzata da infiammazione che coinvolge l’attacco dei tendini e dei legamenti nell’osso (entesi).  L’entesite iniziale è seguita da formazione di osso, che porta alla fusione delle articolazioni colpite.

            In uno studio di associazione caso-controllo in un campione Coreano, sono stati genotipizzati due singoli polimorfismi nucleotidici PD-1.5 C/T e PD-1.9 T/C in 95 pazienti AS e 130 controlli sani.  I risultati suggeriscono un’associazione genetica tra l’allele PD-1.9 che sostituisce la valina con l’alanina 215 e la suscettibilità ad AS.

            In una popolazione di 196 pazienti Cinesi Han e 180 controlli corrispondenti per età e sesso della stessa origine etnica l’allele T del polimorfismo PD-1 rs2227981 era più frequente che nei controlli.  Nel gruppo di pazienti AS la frequenza dell’aplotipo CT (allele PD-1 s2227981 C ed allele PD-1 rs2227982 T) era più alta che nei controlli.  Anche l’allele C del polimorfismo PD-L1 rs822336 era più frequente nei pazienti rispetto ai controlli.  Non sono state trovate associazioni tra i polimorfismi PD-L2 rs1009759/rs6476985 e la malattia.

            Uno studio di associazione genetica caso-controllo è stato condotto da Soleimanifar et al., in 161 pazienti AS Iraniani e 208 controlli normali.  Sono stati investigati due singoli SNP: il PD-1.9 (C, T) nel nucleotide +7625 (Esone 5) ed il PD-1.3 (G/A) nel nucleotide in posizione +7146 dell’introne 4.  Nonostante non ci siano state evidenze dell’associazione dell’SNP PDCD1 con AS, il genotipo CT PD-1.9 correlava con la positività HLA-B27.

            La malattia Vogt-Koyanagi-Harada (VKH) è una condizione autoimmune caratterizzata dal coinvolgimento del CNS associato a panuveite granulomatosa bilaterale e manifestazioni sistemiche, come vitiligo, alopecia e poliposi.  Una risposta autoimmune contro i melanociti o le proteine della famiglia delle tirosinasi potrebbe essere alla base della patogenesi della malattia.  Fattori genetici giocano un ruolo critico nel suo sviluppo.  L’associazione tra la sindrome VKH e gli SNP PD-1 (PD-1.3, PD-1.5 e PD-1.6) è stata investigata nella popolazione Cinese Han analizzando una coorte di 247 pazienti VKH e 289 controlli sani corrispondenti per età, sesso e gruppo etnico.  Hanno trovato che né PD-1.3 né PD-1.6 erano associati con aumentata suscettibilità alla sindrome VKH.  Come suggerito dall’osservazione di frequenze più basse dell’SNP PD-1.5 in pazienti affetti da VKH associata a scoperte extraoculari, è stato ipotizzato che questo SNP potrebbe giocare un ruolo protettivo contro lo sviluppo di manifestazioni extraoculari.  Sono necessari ulteriori studi per dimostrare questi dati in pazienti VKH di diversa origine etnica ed investigare l’associazione tra VKH e altri SNP PD-1.

            Nello studio condotto da Kroner et al., è stata riportata l’associazione del polimorfismo 7146G/A PD-1 con progressione MS.  L’analisi è stata condotta in 939 pazienti MS Tedeschi tra cui 566 pazienti con malattia recidivante-remittente, 279 con MS progressiva secondaria e 94 primaria; sono stati anche analizzati 272 controlli sani bianchi.  Gli effetti della mutazione PD-1 sulla funzione delle cellule T sono stati valutati in linfociti del sangue periferico stimolati con microsfere e su cellule T CD4 purificate da alcuni pazienti.  E’ stato mostrato che la presenza di polimorfismo PD-1 altera l’inibizione mediata da PD-1 della secrezione di citochine delle cellule T.

            La malattia di Graves è un disordine tiroideo autoimmune dipendente da cellule T.  E’ stato condotto uno studio di associazione controllata di casi su 8 polimorfismi di geni PDCD1 su 2671 pazienti GD e 864 controlli reclutati nella popolazione Caucasica UK.  E’ stata rilevata un’associazione tra l’SNP +2375 e GD, mentre un piccolo effetto protettivo è stato visto con il genotipo SNP +6799.

            Nella popolazione Giapponese (banca dati JSNP (http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp.index.html) sono stati documentati 7 SNP nel gene PD-L1, Nonostante non siano state riportate in precedenza associazioni con malattie autoimmuni. Un polimorfismo A/C in posizione 8923 nel gene PD-L1 è stato recentemente rilevato da Hayashi et al., con frequenza aumentata in pazienti GD che non hanno ottenuto remissione.

            La granulomatosi di Wagener (WG) è una condizione autoimmune che si manifesta con granulomi necrotizzanti nel tratto respiratorio e con vasculite dei piccoli vasi.  Nello studio casi-controlli di Sakthivel et al., condotto nella popolazione Caucasica Svedese, 66 pazienti non imparentati a 275 controlli sono stati genotipizzati per tre SNP del gene PDCD1: Introne 1 [+3995 (A/G), rs7565639], Introne 4 [+7146 (A/G), rs11568821] ed Esone 5 [+7785 (C/T), rs2227981].  Sono stati anche analizzati i livelli circolanti di PD-1 solubile in 65 pazienti WG e in 198 controlli.  Per SNP nell’Introne 1, è stata osservata una frequenza ridotta del genotipo AA tra i pazienti senza differenze significative nella frequenza dell’allele in pazienti WG rispetto ai controlli.  Di nuovo, non c’era nessuna differenza significativa nella frequenza del genotipo e dell’allele tra pazienti e controlli per SNP nell’Introne 4 e nell’Esone 5.  Inoltre, il PD-1 solubile serico non era rilevabile.

            La Miastenia Gravis (MG) è una condizione autoimmune dipendente da cellule T.  Nella eziopatogenesi della malattia, gli autoanticorpi diretti contro il recettore nicotinico dell’acetilcolina nella terminazione muscolare ferma la trasmissione neuromuscolare.  Sakthivel et al., hanno genotipizzato 4 SNP PD-1 nel DNA di 269 pazienti MG Svedesi ed in 275 controlli [Introne 1 +3995 (A/G, rs7565639), Esone 2 non-sinonimo +6046 (A/C, rs28615468), Introne 4 +7146 (A/G, rs11568821), ed Esone 5 +7785 (C/T, rs2227981)].  Gli autori non sono riusciti a dimostrare nessuna associazione significativa del gene PD-1 alla MG.  Livelli significativi di PD-1 sono stati rilevati nelle cellule T ed il suo ligando PD-L1 nei monociti di pazienti MG in paragone ai controlli, anche se non era rilevabile il PD-1 secretorio.

Considerazioni conclusive

            Alla luce di ciò che è stato scritto in precedenza la molecola PD-1 ed i suoi ligandi rappresentano chiaramente una via con effetti pleiotropici sull’attivazione delle cellule T, sulla tolleranza immunologica e sul danno tessutale mediato immunologicamente.  Essi agiscono in molti modi o promuovendo lo sviluppo/funzione delle Treg o inibendo l’espansione/attivazione delle cellule T effettrici, proteggendo così contro l’autoimmunità.  I dati ottenuti dall’analisi di modelli sperimentali di autoimmunità in aggiunta alla scoperta dei SNP, trovati in associazione ad alcune condizioni autoimmuni in gruppi etnici peculiari, hanno già fornito sufficienti evidenze a supporto della rilevanza della via PD-1/PD-L1 in tolleranza ed autoimmunità.  Una ottima opportunità di personalizzare la medicina può essere svelata ed introdotta sulla base della combinazione tagliata su misura di nuovi approcci immunoterapeutici diversi per trattare vari disordini.  Quindi, possiamo immaginare il possibile sviluppo futuro degli agonisti PD-1 come una valida nuova opzione terapeutica per fermare l’insorgenza e la progressione di molte condizioni autoimmuni.

Messaggio finale

  • Fattori genetici ed ambientali sono alla base dell’eziopatogenesi dell’autoimmunità.
  • La via PD-1/PD-L1 ha un ruolo nel controllo della tolleranza immunologica.
  • I SNP del gene PD-1 sono associati con molte condizioni autoimmuni nell’uomo.
  • Terapie future in autoimmunità potrebbero agire attraverso la modulazione della via PD-1/PD-L1.

(Tratto da Elena Gianchecchi, Domenico Vittorio Delfino, Alessandra Fierabracci, “Recent insights into the role of the PD-1/PD-L1 pathway in immunological tolerance and autoimmunity”, Autoimmunity reviews; 12:1091-1100, 2013)

One Response to “Recenti scoperte sul ruolo della via PD-1/PD-L1 nella tolleranza immunologica e nell’autoimmunità”

  1. Just want to say your article is as surprising. The clarity in your
    post is just excellent and i could assume you are an expert on this subject.
    Well with your permission allow me to grab your feed to keep up to date with forthcoming post.
    Thanks a million and please continue the gratifying work.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: