L’Infermiere e la ricerca farmacologica: studi sull’efficacia di farmaci vegetali nella terapia dell’artrite sperimentale

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PERUGIA

Dipartimento di Medicina

Corso di Laurea in Infermieristica

Sede di Foligno

Mariani

      Laureanda:                                                                      Relatore:

Romina Cimarelli                                                 Prof. Delfino Domenico

Anno Accademico 2014/2015

INDICE

1.INTRODUZIONE

1.1 L’artrite Reumatoide

1.2 Epidemiologia

1.3 Eziologia

1.4 Patogenesi

2. TERAPIA FARMACOLOGICA

2.1 La Terapia Farmacologica Attuale

2.2 La Medicina Tradizionale Complementare (MTC) e la Medicina Convenzionale

3. ARTOCARPUS TONKINENSIS

3.1 Descrizione e Proprietà

4.IL RUOLO DELL’INFERMIERE NELL’ASSISTENZA E NELLA RICERCA

4.1 Modelli assistenziali nel paziente con Artrite Reumatoide

4.2 L’infermiere e la ricerca

5. OBIETTIVI E SCOPO DELLO STUDIO

6. MATERIALI E METODI

6.1 Selezione dei Campioni

6.2 Studio farmacologico in vitro

6.3 Studio dell’espressione genica

6.3.1 Retrotrascrizione dell Rna

6.3.2 Real Time

7. RISULTATI

7.1 DISCUSSIONE

8. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI / SITOGRAFICI

1. INTRODUZIONE

In questo elaborato parlerò dell’importanza della ricerca farmacologica, in particolare dello studio inerente farmaci vegetali al fine di validare la loro efficacia nel trattamento e la cura dell’artrite.

Inizialmente descriverò nello specifico l’Artrite Reumatoide delineandone le caratteristiche principali e successivamente andrò a parlare sia della Medicina Convenzionale che attualmente viene messa in campo nella cura dell’AR, che della Medicina Tradizionale e Complementare. In particolare parlerò di una pianta: l’Artocarpus Tonkinensis che da secoli viene utilizzata in Vietnam come rimedio alle malattie reumatiche e ai mal di schiena.

Insieme alla parte sperimentale che mostra la concreta capacità di azione dell’AT ho voluto inoltre sottolineare l’importanza della ricerca scientifica. Questa infatti riveste un ruolo fondamentale in tutte le professioni sanitarie e perciò deve essere considerata una parte integrante della disciplina infermieristica, in quanto consente di revisionare, sviluppare e far evolvere le competenze e le nozioni che caratterizzano questa professione oltre ovviamente a garantire una migliore assistenza e cura del malato. 5

1.1 ARTRITE REUMATOIDE

L’Artrite Reumatoide (AR) è una malattia sistemica cronica a patogenesi autoimmune ed eziologia tuttora sconosciuta.

Recentemente però alcuni studi hanno ipotizzato che l’AR possa essere una patologia multifattoriale, in quanto la sua espressione trova una stretta connessione tra i fattori ambientali ( il fumo di sigaretta, l’inquinamento atmosferico, i batteri e i virus) e quelli costituzionali ( il sesso, l’obesità, la nulliparità) che funzionano come innesco alla malattia nei soggetti che presentano una predisposizione genetica.1

L’AR è caratterizzata principalmente da una sinovite infiammatoria a carico delle articolazioni diartroidali, che provoca una progressiva ed irreversibile distruzione della matrice cartilaginea ed ossea e la produzione di autoanticorpi, tra cui il fattore reumatoide (FR) e gli anticorpi anti peptide ciclico citrullinato (anti-CCP).2

Il processo flogistico che si instaura a carico della sinovia, la membrana che racchiude le cavità articolari, determina una sintomatologia dolorosa associata a iperplasia sinoviale, deformità e progressiva perdita della funzionalità della articolazioni da parte dell’individuo affetto.

Sebbene colpisca elettivamente le articolazioni diartroidali, l’AR può presentare manifestazioni extra articolari a carico dell’intero organismo, in particolare dell’apparato respiratorio, cardiocircolatorio, del sistema nervoso e di quello reticolo-endoteliale (vedi Tabella 1)3. Spesso accompagnata da febbre, astenia e calo ponderale, l’AR si contraddistingue per un’altra particolare caratteristica rappresentata dalla formazione di noduli reumatoidi sottocutanei o intracutanei.3 6

La presenza di manifestazioni sistemiche si traduce di conseguenza in una prognosi più sfavorevole, in quanto la persona affetta da AR subisce un notevole peggioramento per quanto concerne la qualità della vita.

Tabella 1. Manifestazioni extra – articolari dell’AR3

 DISTRETTI E ORGANI  

MANIFESTAZIONI

 Cardiovascolare Vasculite, Pericardite e Miocardite

Patologie Della Mitralica, Difetti Di Conduzione

 Polmone Polmonite, Effusioni Pleuriche, Noduli Pleurici

Fibrosi Interstiziali

 Apparato Visivo Sclerite, Episclerite

Congiuntivite, Cheratocongiuntivite Secca

 Sistema Nervoso Sindrome Da Compressione Neurale, Neuriti

Mielopatie Cervicale, Problemi a carico del SNC

 Sistema Emopoietico Trombocitopenia

Granulocitopenia, Eosinofilia,

Crioglobulinemia e Anemia

Iperviscosità

 Cute Ulcere distali

Eritema palmare e Vasculite cutanea

 Rene Amiloidosi

Glomerulo nefriti

Vasculiti

 Fegato Aumento delle transaminasi

 

 

Nonostante le sue potenzialità distruttive, il decorso clinico della patologia trova però un’espressione clinica eterogenea e alquanto imprevedibile in base a diversi 7

aspetti quali: il numero di articolazioni colpite, l’eventuale interessamento di distretti extra articolari, la precoce comparsa di un danno erosivo osteo-cartilagineo e di disabilità.

Un altro aspetto rilevante che consente di definire in modo più specifico il decorso clinico della malattia e la sua gravità è rappresentato dalla positività sierologica ai cosiddetti anticorpi anti peptide ciclico citrullinato (anti-CCP), in quanto tale positività indicherebbe una forma artritica più aggressiva e di conseguenza una prognosi peggiore.4

In ragione al carattere progressivo ed altamente invalidante, tale patologia ha una significativa influenza sia sulla salute che sulla qualità della vita quotidiana delle persone affette da AR. All’aspetto sociale si associa inoltre un pesante impatto anche sul piano economico. La cura e l’assistenza di tale patologia si traduce in ingenti costi non solo per il Sistema Sanitario Nazionale ma per il malato stesso che a causa della sua disabilità non è più in grado di adempiere alle abituali attività lavorative. 8

1.2 EPIDEMIOLOGIA

Secondo studi epidemiologici l’AR risulta essere una delle più comuni malattie infiammatorie a carattere cronico e a patogenesi autoimmune.

Si stima colpisca circa l’1 – 2% della popolazione mondiale in età adulta, con un incidenza annuale di 2- 4 nuovi casi su 10.000 persone. 3

Pur essendo una malattia ubiquitaria, quindi diffusa indistintamente in tutte le parti del mondo, è al contempo vero che la sua incidenza trova importanti distinzioni a seconda delle aree geografiche e dei gruppi etnici.

È importante inoltre sottolineare come tale patologia pur manifestandosi prevalentemente intorno alla quarta-quinta decade di vita, possa in realtà colpire qualsiasi fascia di età. In particolare si nota che in età giovanile la patologia predilige il sesso femminile a quello maschile con un’incidenza F:M di 3:1. Questo aspetto implicherebbe che nella genesi dell’AR possano entrare in gioco anche dei fattori ormonali e cioè, l’effetto stimolatore che gli estrogeni produrrebbero sul sistema immunitario. (2,5)

Si è visto inoltre che con l’avanzare dell’età il rapporto F:M tende ad eguagliarsi anche se di contro aumenta l’incidenza della patologia.3 Ciò si associa ad una prognosi peggiore in quanto non solo si riscontra una maggiore frequenza di manifestazioni sistemiche ma anche perché le articolazioni subiscono un declino più severo e rapido. 9

1.3 EZIOLOGIA

Sebbene ad oggi le cause scatenanti l’AR rimangano ignote, recenti ricerche hanno ipotizzato che tale patologia possa originare dalla concomitante interazione di diversi fattori, tra i quali: la predisposizione genetica, stilo di vita e fattori ambientali. Studi clinici, condotti su familiari hanno rilevato che, circa il 10% dei pazienti affetti da AR ha la possibilità di avere parenti di primo grado colpiti dalla malattia. 3

In particolare, in altri studi clinici riguardanti casi di gemelli monozigoti è stato rilevato un tasso quattro volte maggiore di concomitanza della patologia (15% – 30%) rispetto ai gemelli dizigoti (5%), i quali invece possono andare incontro ad AR con una probabilità pari a quella di fratelli non gemelli.6

L’analisi del genoma umano inoltre, sembrerebbe dare un imput al fatto che il sistema immunitario giochi un ruolo importante per quanto riguarda la genesi della malattia. Più nello specifico, già a partire dalla fine degli anni ’70, è stata confermata la stretta concordanza tra HLA ( human leukocyte antigen) ed AR.

Sebbene però da molti anni si indaghi in merito all’associazione tra la MHC e la suscettibilità alle malattie autoimmuni, ad oggi risulta ancora sconosciuto e poco chiaro il ruolo che queste molecole hanno rispetto alla malattia.(7,8)

Mentre è chiaro che gli individui che esprimono alleli HLA-DRB1 * 0101, * 0401, * 0404, e * 0405 sono ad aumentato rischio di sviluppare AR.(7,9)

L’AR quindi colpirebbe con maggiore frequenza quegli individui che presentano un particolare aplotipo HLA. (vedi tabella 2)10

Tabella 2. Nomenclatura degli alleli HLA-DR e la loro associazione con l’Artrite Reumatoide.11

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Perciò, se da un lato la genetica influisce significativamente sull’insorgenza di tale patologia, di contro si può affermare che questo elemento da solo non spiega l’incidenza dell’AR. Infatti, come detto precedentemente è stato ipotizzato che l’origine dell’AR sia da ricondurre al concomitante coinvolgimento non solo di fattori genetici ma anche di quelli ambientali e allo stile di vita condotto.

Tra le varie ipotesi si pensa che l’AR scaturisca nel momento in cui un soggetto geneticamente predisposto entri in contatto con un agente patogeno esogeno. Tale incontro produrrebbe una risposta abnorme da parte del sistema immunitario che 11

di norma è adibito alla difesa dell’organismo umano da attacchi esterni attraverso la formazione di anticorpi o mediante l’attivazione di reazioni cellulari. In soggetti geneticamente suscettibili, l’intervento di fattori costituzionali e/o ambientali innesca perciò un processo autoimmune con l’attivazione di cellule T artritogene e la produzione di anticorpi anticitrullina (anti-CCP) e fattore reumatoide (FR).1

Nel caso dell’AR, il sistema immunitario, privo della sua capacità funzionale, inizia ad attaccare il tessuto sano, considerandolo come non self, in particolare le risposte cellulari attivate dall’organismo vanno a colpire direttamente le componenti articolari provocando un intenso processo infiammatorio successivamente seguito da un progressivo danno a carico dei distretti interessati.

Tra i diversi agenti patogeni chiamati in causa, seppur non confermato da evidenze scientifiche rientrano il virus della Rosolia (Rubella virus), il Citomegalovirus(CMV), l’Epestein-Barr (EBV, herpesvirus).(11,12 ,13).

E’ stato invece acclarato con certezza che altri fattori ambientali quali il fumo di sigaretta, l’inquinamento atmosferico dato dallo smog, dagli oli e dai gas industriali influiscano in modo significativo sullo sviluppo della malattia. Tra questi elementi è importante inoltre sottolineare come il fumo di sigaretta sia associato maggiormente non solo alla possibilità di sviluppo della malattia ma anche alla sua aggressività evolutiva e alla sieropositività per il fattore reumatoide e gli anticorpi anti-peptide ciclico citrullinato.(1,7) 12

1.4 PATOGENESI

La cronicità e la potenzialità distruttiva sono tratti caratteristici della risposta infiammatoria che si instaura a carico della membrana sinoviale nel soggetto con AR. Tali manifestazioni non sono altro che l’espressione dell’attività svolta dal sistema immunitario nel momento in cui un soggetto geneticamente predisposto entra in contatto con uno degli ipotetici “trigger”.14

La principale popolazione cellulare che caratterizza l’infiltrato all’interno della cavità sinoviale è quella dei linfociti T, i quali inizialmente riconoscono l’antigene dell’agente esogeno grazie ai macrofagi e alle cellule dendritiche che si trovano sulla superficie della membrana sinoviale. Oltre ai linfociti T nella sinovia reumatoide è riscontrabile anche la presenza di un infiltrato più o meno abbondante di linfociti B e di plasmacellule, responsabili della produzione di anticorpi.

La produzione di questi anticorpi che attaccano le componenti del tessuto sinoviale e la presenza di numerosi mastociti che riversano il loro contenuto all’interno della cavità possano contribuire notevolmente al mantenimento del processo infiammatorio. A ciò si aggiunge la presenza numerosa di macrofagi, i quali secernono una un quantità cospicua di citochine pro-infiammatorie e fattori di crescita come IL 1; IL 2; IL 6; IL10; IL13; IL15; IL17 e TNF. (vedi figura 1). Queste non solo sono responsabili di molte manifestazioni cliniche a carico delle articolazioni come ad esempio l’infiammazione della sinovia e del liquido in essa contenuta ma anche di quelle a livello sistemico.

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Figura 1: Patogenesi Dell’artrite Reumatoide15

L’intensa attività proliferativa che vede protagonisti molteplici popolazioni cellulari si traduce in una modifica istopatologica della sinovia che a causa dell’infiltrato cellulare diventa edematosa ed iperplastica; si espande andando a costituire il panno ( tessuto di granulazione infiammato) fino a protrudere nella cavità articolare sottoforma di proiezioni villose e provocare la demineralizzazione e la distruzione dell’osso. Alla degradazione ossea si associa anche quella della cartilagine articolare a causa degli enzimi proteolitici, i quali facilitano non solo il danno tessutale a livello locale ma anche l’inibizione della sintesi di nuove molecole della matrice (vedi Figura 2) .(4,16)

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Figura 2: Comparazione tra un’articolazione normale e una affetta da Artrite Reumatoide.17

L’evoluzione dei meccanismi patogenetici dell’AR può essere suddivisa perciò in tre fasi:

  1. FASE DI INFIAMMAZIONE NON SPECICA : è la fase iniziale in cui si attiva una risposta infiammatoria aspecifica scatenata nel momento in cui un soggetto predisposto geneticamente entra in contatto con un agente esogeno (ad oggi da confermare scientificamente).
  2. FASE DI AMPLIFICAZIONE : in questa seconda fase si assiste all’attivazione delle cellule T e alla stimolazione delle cellule B e delle

plasmacellule. Questa intensa attività proliferativa porta al rilascio di numerose citochine responsabili del mantenimento della flogosi.

  1. FASE DI INFIAMMAZIONE CRONICA E DANNO TISSUTALE: è la fase in cui la cascata di numerose citochine pro infiammatorie favorisce la produzione e il rilascio di enzimi proteolitici i quali sono responsabili dell’insorgenza del danno tissutale a carico sia della componente ossea che della componente cartilaginea.

 

  1. TERAPIA FARMACOLOGICA

2.1 TERAPIA FARMACOLOGICA ATTUALE

Dato il fatto che ad oggi l’eziologia dell’AR rimane ancora ignota e che il meccanismo patogenetico è stato spiegato solamente in parte, la terapia farmacologica, seppur in costante evoluzione, non ha al momento ottenuto risultati tali da curare in modo definitivo la malattia.

I diversi interventi terapeutici che vengono messi in atto a seconda del paziente e dell’aggressività della patologia sono diretti esclusivamente ad alleviare e ridurre al minimo i segni e sintomi caratteristici dell’AR quali il dolore, l’infiammazione sinoviale e la rigidità articolare. Il trattamento farmacologico cerca inoltre di proteggere e prevenire lo sviluppo progressivo di un danno tissutale a carico delle strutture articolari, ma anche di mantenere le capacità funzionali ed evitare eventuali deformità e disabilità, in modo tale da garantire al paziente una qualità della vita più normale possibile. A questi si associa un altro aspetto fondamentale della terapia farmacologica e cioè quello di aumentare la sopravvivenza dei pazienti, in quanto è ormai noto che tale patologia riduce significativamente gli ani di vita.4

Per poter raggiungere questi obiettivi è fondamentale iniziare precocemente la terapia farmacologica, mentre nel caso in cui la patologia sia ormai ad uno stadio avanzato la terapia ha lo scopo di minimizzare l’attività della malattia al fine di prevenire la progressione del danno articolare e dei deficit funzionali connessi.18 Se da un lato la terapia farmacologica gioca un ruolo fondamentale nel trattamento dell’AR, dall’altro è importante sottolineare come tale patologia data la sua complessità richiede anche un intervento multidisciplinare da parte di 17

un’equipe costituta da diversi professionisti nel campo sanitario poiché la persona affetta da AR deve far fronte a problemi di diversa natura: da quelli inerenti la capacità funzionale, la possibile disabilità quindi l’aspetto psicosociale.

Come detto in precedenza l’AR è una sindrome che raggruppa in sé varie forme di malattia, con un’ evoluzione clinica che trova manifestazioni diverse a seconda del paziente. La sua espressione eterogenea rende necessaria perciò una scelta sul piano terapeutico diversa da soggetto a soggetto a seconda delle manifestazioni cliniche. 20

Essenzialmente però, i farmaci antireumatici prevalentemente impiegati nella cura della AR possono essere suddivisi in:

FANS ( NSAIDs ): farmaci non steroidei anti-infiammatori,

GLUCOCORTICOIDI

DMARDs: farmaci antireumatici modificanti la malattia

Queste tre categorie farmacologiche differiscono fra loro per alcuni aspetti, quali: il grado di tossicità, la capacità di rallentare la progressione della malattia e gli effetti nel corso del tempo.19 Ad esse, grazie alle continue ricerche e agli sviluppi della biologia molecolare, si è aggiunta una quarta categoria costituita dai cosiddetti farmaci biologici i quali colpiscono selettivamente le componenti cellulari come ad esempio l’IL 1, l’IL 6 e il TNF responsabili del processo infiammatorio a carico della sinovia. Essi sono potenti agenti prodotti farmaceutici capaci di influenzare e inibire l’azione prodotta dalle citochine, l’attivazione cellulare e la trascrizione di geni responsabili del mantenimento del processo flogistico.19

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Tabella 3: Farmaci Impiegati Nella Cura Dell’artrite Reumatoide

Per quanto riguarda i FANS, si può affermare che questi vengono impiegati esclusivamente con lo scopo di attenuare e ridurre la sintomatologia dolorosa e lo stato infiammatorio tipici della malattia. Infatti sebbene producono un rapido sollievo nel paziente è al contempo vero che la loro azione non è in grado di rallentare la progressione della malattia ne di impedire il danno a carico delle articolazioni. I benefici che ne derivano sono dati esclusivamente dall’effetto antinfiammatorio e analgesico che il farmaco fornisce. I FANS vengono inoltre considerati farmaci di prima scelta nel trattamento della patologia proprio per la rapidità con cui viene ad esplicarsi la loro azione analgesica. Allo stesso modo i glucocorticoidi agiscono con una potente attività antinfiammatoria che riesce in breve tempo a migliorare la sintomatologia. (17, 18) Insieme all’efficace azione antinfiammatoria, sono considerati però anche potenti agenti immunosoppressivi. 19

I glucocorticoidi di sintesi sono infatti un gruppo di farmaci impiegati nel campo medico come agonisti del cortisolo, un ormone prodotto e secreto dalla regione corticale dei surreni, e dunque in grado di produrre i medesimi effetti associati al cortisolo. Questa categoria di farmaci è in grado di mimare l’attività di questo ormone presente all’interno dell’ organismo umano. Più nello specifico i glucocorticoidi si sostituiscono al cortisolo endogeno nel momento in cui l’azione di quest’ultimo non è fisiologicamente sufficiente.20 Diversamente dai FANS però i glucocorticoidi riescono in un certo qual modo a rallentare la progressione della malattia e ridurre la distruzione osteo-articolare, sia durante lo stadio iniziale che nella fase avanzata. Agli effetti benefici di contro si associano però anche quelli negativi come ad esempio l’iperglicemia, il diabete, le alterazioni elettrolitiche e psicotiche in soggetti predisposti e l’osteoporosi in pazienti anziani. Data perciò la loro componente tossica, l’impiego dei glucocorticoidi può essere effettuato solo in dosi molto basse e per un breve periodo.19 L’altra classe di farmaci utilizzati nel trattamento della AR è rappresentata invece dai farmaci antireumatici che modificano la malattia (DMARD: “Disease modifying antirheumatic drugs”), a cui appartengono: il METHOTREXATO, i SALI D’ORO, la SULFASALAZINA, ecc. La loro caratteristica fondamentale è quella di avere la capacità di modificare e controllare i meccanismi responsabili del mantenimento della patologia e in rari casi di arrestare la progressione della stessa. Questo perché la loro attività si concentra a livello di alcune cellule del sistema immunitario attraverso l’inibizione di una serie di molecole quali: prostaglandine, leucotrieni e trombossani responsabili presenti in elevate quantità durante la flogosi della sinovia.21 Perciò sebbene la loro azione antinfiammatoria e analgesica sia minima, 20

è altresì vero che i DMARD riducono e interrompono il processo infiammatorio e il conseguente danno osteo-articolare ad esso legato.4 L’impiego di tali farmaci richiede inoltre un attento e periodico monitoraggio sierologico per valutare non solo la sua efficacia ma anche l’eventuale comparsa di effetti collaterali avversi.

In ultima istanza è importante ricordare come recentemente grazie al progresso nel campo della biologia molecolare vanno affermandosi i cosiddetti farmaci biologici di norma impiegati nel momento in cui un paziente presenti una forma della malattia persistentemente attiva, incapace di rispondere ai convenzionali trattamenti terapeutici. Tuttavia il loro impiego non è frequente in quanto il rapporto rischio beneficio mostra come gli effetti benefici siano comunque minimi rispetto a quelli avversi, come ad esempio l’elevata suscettibilità a contrarre infezioni. 21

2.2 LA MEDICINA TRADIZIONALE COMPLEMENTARE E LA MEDICINA CONVENZIONALE

Nel “Rapporto Mondiale Sulle Malattie Croniche”, l’OMS mostra un’allarmante diffusione a livello mondiale delle malattie non trasmissibili stimando che queste ogni anno portano al decesso di 36 milioni di persone. Le malattie croniche sono perciò ad oggi considerate la principale causa di morte nel mondo.22Il considerevole aumento di tali patologie può essere ricondotto principalmente dall’innalzamento della sopravvivenza e dall’invecchiamento della popolazione.23

Perciò, se da un lato il continuo e inarrestabile progresso compiuto in ambito scientifico ha portato con sé un allungamento della vita media debellando quelle che un tempo venivano considerate malattie infettive mortali, dall’altro si assiste ad un notevole incremento di patologie croniche ed invalidanti, che vanno a gravare enormemente sulle spese del Sistema Sanitario Nazionale e sullo stesso cittadino. Questa realtà mostra quindi i limiti della medicina convenzionale che, nonostante la sua incessante evoluzione, non ha ad oggi trovato risposte nella cura definitiva alle malattie croniche. L’allarmante incremento su scala mondiale di tali patologie ha portato i pazienti a ricorrere sempre più frequentemente all’impiego della medicina tradizionale (pratiche, metodi e conoscenze relative a prodotti medicinali a base vegetale, animale e o minerale, tecniche manuali ed esercizi per mantenere il benessere e per curare, diagnosticare, prevenire le malattie) e della medicina complementare-alternativa (attraverso l’uso di prodotti erboristici e rimedi omeopatici).24 Questa realtà trova conferma in numerosi studi scientifici che hanno dimostrato ed evidenziato come molti pazienti soprattutto quelli affetti da particolari patologie croniche adottano sempre di più sia la medicina 22

tradizionale e che quella complementare.25 In particolare, per quanto concerne il trattamento dell’AR, l’impiego di piante ed estratti alle erbe è stato associato a potenziali effetti benefici.26 La scelta delle medicine tradizionali e non convenzionali ormai diffusa a livello mondiale, è dettata da vari motivi tra cui: l’ aumento della domanda dei servizi sanitari, il crescente bisogno di maggiori informazioni che rendono l’utente più consapevole in merito alle diverse opzioni a disposizione, la costante insoddisfazione per quanto riguarda i servizi esistenti e il rinato interesse per la “cura della persona nella sua interezza” e la prevenzione delle malattie, aspetti caratteristici della medicina non convenzionale. La medicina tradizionale e complementare alternativa focalizza la sua attenzione sull’importanza della qualità della vita, soprattutto nel momento in cui non è possibile avvalersi di trattamenti terapeutici in grado di combattere e debellare la malattia.23 Questo rilevante aspetto ha fatto si che l’OMS ( l’Organizzazione Mondiale della Sanità ) muovesse dei grandi passi verso l’integrazione tra la Medicina Tradizionale e Complementare e la Medicina Convenzionale dei paesi Occidentali attraverso l’attuazione di un programma documentato nel testo “WORLD HEALT ORGANIZATION TRADITIONAL MEDICINE STRATEGY 2014-2015“. Questo rivoluzionario processo ha lo scopo di apportare delle considerevoli modifiche non solo sul piano assistenziale, ma anche economico e quindi di ridurre le spese in termini di costi diretti e indiretti.27 Se infatti la medicina tradizionale nei paesi in via di sviluppo rappresenta molto spesso l’unica via di accesso alle cure, nei paesi industrializzati apre invece uno scenario alternativo per quanto concerne le malattie croniche, consentendo l’attuazione di nuovi modelli assistenziali e di cura. 23

Il documento redatto dall’OMS vuole offrire e sviluppare il concetto di salute sottolineando l’importanza della “whole person care“, e cioè la cura della persona in senso olistico, nella sua globalità, prendendo in considerazione tutti quegli aspetti che vanno a costituire lo stato di salute e benessere psicofisico e sociale di un individuo. Insieme a ciò vuole inoltre incrementare l’autonomia del paziente promuovendo l’autocura nei diversi sistemi sanitari nazionali mondiali e la partecipazione sempre più attiva del paziente nel processo assistenziale.28

3. ARTOCARPUS TONKINENSIS

3.1 PROPRIETÀ

L’Artocarpus è una pianta appartenente alla famiglia delle Moraceae. Rappresentata da un’innumerevole quantità di specie, circa 50, diffuse prevalentemente nelle regioni tropicali e subtropicali asiatiche. Questa pianta trova da sempre un ampio impiego nella medicina popolare e tradizionale. 29 In particolare, in Vietnam il genere Artocarpus Tonkinensis viene usato da oltre 100 anni come rimedio naturale alle malattie articolari reumatiche e nella prevenzione di stati infiammatori. L’utilizzo dell’Artocarpus per il trattamento per le malattie reumatiche in Vietnam incoraggia fortemente la possibilità di effettuare prove con questo fitoterapico popolare anti-reumatico. Molti ricercatori sono infatti interessati a validare i reali effetti benefici e comprendere quali siano le proprietà capaci di indurre un miglioramento delle forme reumatiche.

Le ricerche scientifiche che nel tempo sono state affrontate in materia hanno confermato che gli estratti grezzi derivanti dal genere Artocarpus Tonkinensis sono capaci di produrre effetti antinfiammatori in un modello di artrite sperimentale, artrite indotta da collagene (CIA). Infatti nei topi in cui è stata indotta la malattia è stato registrato un netto miglioramento a seguito della somministrazione dell’estratto sintetico di Artocarpus Tonkinensis. Tale trattamento ha di fatto mostrato una notevole riduzione della gravità e dell’incidenza della malattia. Gli stessi studi hanno inoltre posto l’attenzione anche sul potenziale grado di tossicità derivante dalla somministrazione della pianta, constatando che l’uso di dosi accettabili di tale sostanza non induce significativi effetti collaterali sui topi sottoposti al trattamento. Questo aspetto non 25

esula però dal fatto che ulteriori ricerche in tale ambito sono di estrema importanza.30 Perciò se da un lato sono evidenti i reali effetti antinfiammatori e il significativo miglioramento dei sintomi tipici delle malattie artritiche, ad oggi la ricerca deve ancora spiegare quali siano i meccanismi che comportano tali effetti benefici.31 26

4. RUOLO DELL’INFERMIERE NELL’ASSISTENZA E NELLA RICERCA

4.1 MODELLI ASSISTENZIALI

L’esponenziale aumento dell’incidenza delle malattie croniche registrato ogni anno a livello mondiale mostra come i diversi Sistemi Sanitari Nazionali necessitano di modifiche significative in merito all’assistenza rivolta ai propri pazienti, finora diretta esclusivamente al trattamento di stati acuti ed interventi di elezione. L’assistenza alla cronicità rappresenta perciò la fetta più considerevole del lavoro e della spesa che il SSN si trova incessantemente ad affrontare.

Nel caso specifico dell’AR, nonostante i continui progressi compiuti dalla scienza nell’approccio farmacologico, è corretto affermare che essa rimane ancora adesso una delle patologie a carattere cronico più impattanti sia per quanto riguarda la Sanità Pubblica sia per l’aspetto sociale. La clinica di questa malattia seppur con espressioni diverse da caso a caso mostra come la sua progressione nel tempo produca effetti altamente invalidanti, compromettendo in modo significativo la qualità della vita del malato. Tali aspetti richiedono perciò una revisione nell’approccio e nell’assistenza del paziente con AR cronica con lo scopo principale di migliorare la qualità della vita, rispondendo in modo più efficace ed appropriato ai bisogni complessi e alle esigenze personali che contraddistinguono ogni persona affetta da una malattia cronica. Più nello specifico la gestione dell’AR rende indispensabile, per il carattere cronico e invalidante della patologia, un corretto approccio diagnostico e un precoce intervento terapeutico. I malati affetti da AR necessitano di una continuità assistenziale, di chiare informazioni sulle strutture e i servizi a disposizione e sulla malattia per partecipare attivamente 27

al processo assistenziale e sviluppare al meglio una capacità di autogestione e autocura. Per ottenere outcomes positivi, risulta quindi necessario intraprendere non soltanto un’assistenza personalizzata e specifica per ogni paziente, ma anche trattamenti efficaci all’interno di un sistema di cura organizzato ed integrato, con il supporto del self-management e del follow-up. In questa direzione, nel 2009, Il National Collaborating Centre for Chronic Conditions (NCC-CC) in collaborazione con il National Institute for Health and Clinical Excellence (NICE), si è mosso per stilare delle linee guida sulla gestione ed il trattamento dell’AR. Nelle linee guida del NCC-CC il perno dell’assistenza al paziente con AR è rappresentato da un team multidisciplinare, composto da varie figure professionali: un infermiere specializzato, un fisioterapista, un terapista occupazionale, uno psicologo ed un podologo, tutti implicati nella gestione terapeutica-assistenziale del paziente con l’obiettivo di minimizzare l’impatto della malattia sulla vita quotidiana del malato sollecitandolo proattivamente a comportamenti funzionali. 19

A fronte di ciò il modello più affine agli obiettivi sopra elencati è quello del CHRONIC CARE MODEL che si propone di superare l’approccio per la patologia (disease illness) concentrando la sua attenzione sull’approccio alla persona nella sua globalità (person-focus). È importante inoltre sottolineare come la sua efficacia sia dimostrata e riconosciuta dalle Evidenze Scientifiche. Il successo di questo modello assistenziale è dato dalla stretta relazione che intercorre tra il paziente e il team multi professionale che guarda alla persona attraverso una visione olistica, garantendo un benessere globale: fisico, psicologico, socioculturale e spirituale. I diversi operatori che esercitano la loro 28

attività, rispettando le linee guida e i protocolli integrati, informano ed educano il paziente e la famiglia sulla malattia rendendoli veri esperti in materia e quindi capaci di autogestione.32

Negli ultimi anni in molte regioni italiane anni si sta diffondendo il “Percorso Diagnostico Terapeutico Assistenziale”. Questo piano fa si che malattie croniche tra cui l’AR, vengano trattate con il contributo di più attori sanitari all’interno di un equipe multidisciplinare, guardando al paziente secondo una visione olistica. Da ciò emerge, confermato da un’ampia letteratura, l’importanza della figura infermieristica nell’approccio e nella cura del malato, in particolare delle persone affette da malattie croniche e reumatiche. L’infermiere esperto e adeguatamente formato, è un “alleato” potente dei malati reumatici e un “prezioso e indispensabile” professionista che opera a fianco del reumatologo, che svolge in piena autonomia numerose attività, come ad esempio il counselling e la patient education.33 L’evoluzione del profilo professionale infermieristico, avvenuta recentemente grazie alle modifiche normative ha ridefinito in modo sostanziale e moderno la figura dell’infermiere in ogni suo aspetto. Oggi l’infermiere non è più una figura passiva adibita a semplici mansioni affidate da terzi; ora grazie anche alla sua formazione partecipa in modo attivo all’assistenza e alla cura del malato ed è parte integrante di un’equipe di professionisti che collabora in modo sinergico; è un professionista che coordina l’attuazione dei percorsi assistenziali, svolgendo un’attività educativa nei confronti del malato e dei familiari. Lo stesso Codice Deontologico rafforza queste caratteristiche enunciando all’art. 14 che: “L’infermiere riconosce che l’interazione fra professionisti e l’integrazione interprofessionale sono modalità fondamentali per far fronte ai bisogni 29

dell’assistito.” Inoltre aggiunge nell’art. 41 che: “L’infermiere collabora con i colleghi e gli altri operatori di cui riconosce e valorizza lo specifico apporto all’interno dell’équipe”. Ed è sempre il Codice Deontologico ad evidenziare l’importanza dell’infermiere nel processo assistenziale e le competenze professionali che lo caratterizzano quando all’art 2 afferma che: L’assistenza infermieristica è servizio alla persona, alla famiglia e alla collettività. Si realizza attraverso interventi specifici, autonomi e complementari di natura intellettuale, tecnico-scientifica, gestionale, relazionale ed educativa.” La collaborazione di diversi professionisti, attraverso le specifiche competenze di ciascun ruolo,sono indirizzate verso un unico scopo: garantire al paziente il massimo standard assistenziale.

Insieme al Chronic Care Model è stato elaborato un altro piano assistenziale rivolto al paziente affetto da una malattia reumatica cronica. Questo modello viene definito “CASE MANAGMENT” e consente di assicurare interventi e setting assistenziali adeguati, appropriatezza e qualità dei servizi offerti e contenimento dei costi e riduzione della degenza ospedaliera. Il CASE MANAGMENT è un processo che consente di valutare, programmare, coordinare, controllare le opzioni ed i servizi richiesti per soddisfare le esigenze educative, di salute e di cura, degli individui, usando la comunicazione e le risorse disponibili per promuovere ottimi risultati. La crescente domanda assistenziale da parte dei pazienti con AR ha individuato nel CASE MANAGER INFERMIERISTICO quella figura in grado, attraverso competenze specialistiche, di rispondere ai bisogni del malato garantendo un’assistenza altamente personalizzata e di qualità. Il case manager si delinea come un 30

professionista dotato di autonomia e potere decisionale responsabile dei diversi servizi offerti al malato. Data la componente cronica dell’AR il case manager ha l’importante compito di far conoscere al meglio al paziente le caratteristiche della patologia; deve educarlo alla gestione della terapia farmacologica e assisterlo affinché sappia affrontare e risolvere le problematiche che nel quotidiano può incontrare a causa della malattia. L’infermiere case manager assume perciò il ruolo di gestore del caso clinico diventando il punto di riferimento del paziente, dei familiari e degli altri operatori con cui collabora con la funzione di spiegare il percorso, garantirne l’applicazione aiutando a superare i punti critici.34 Attraverso lo sviluppo di questo modello assistenziale viene garantito al malato un servizio di alta qualità ed efficienza, che mostra una stretta collaborazione tra diversi professionisti sanitari che agiscono in modo coeso e la partecipazione attiva dello stesso paziente al percorso assistenziale, al fine di apportare un beneficio di fondamentale importanza per la persona: la massima autonomia nella gestione della malattia e della salute. 31

4.2 IL RUOLO DELL’INFERMIERE NELLA RICERCA

I recenti progressi inerenti alla formazione infermieristica, hanno delineato una nuova e più consapevole attenzione degli infermieri alla ricerca e alle pubblicazioni scientifiche. Nonostante ciò, come confermato dalla letteratura, la ricerca infermieristica risulta più sviluppata negli Stati Uniti e nei Paesi Anglosassoni piuttosto che in Italia. Il divario è dato dal fatto che in questi Paesi gli infermieri dediti alla ricerca e i dipartimenti infermieristici universitari usano una metodologia programmatica alla ricerca aderendo inoltre a progetti multi professionali, che in Italia ad oggi non sono ancora ben sviluppati.

Andando ad analizzare il significato della parola ricerca, questa può essere intesa come quel processo intenzionale che consente di accrescere il sapere di una disciplina, un indagine sistemica e oggettiva intrapresa attraverso l’impiego del metodo scientifico, che consente di validare e implementare quelle che sono le conoscenze sui fatti e le relazioni che intercorrono tra i vari fenomeni presenti nella realtà. La ricerca pertanto, come confermato dall’International Council of Nurses, può e deve essere considerata parte integrante della disciplina infermieristica, in quanto consente di revisionare, sviluppare e far evolvere le competenze e le nozioni che caratterizzano questa professione.35 L’infermiere perciò, al fine di migliorare il suo sapere disciplinare, può orientare i suoi studi e le sue analisi in qualsiasi ambito che faccia riferimento al METAPARADIGMA DEL NURSING: PERSONA, SALUTE, AMBIENTE, INFERMIERISTICA. Lo stesso Codice Deontologico evidenzia chiaramente l’importanza della ricerca. L’articolo 11, riconosce infatti che: “L’infermiere fonda il proprio operato su conoscenze validate e aggiorna saperi e competenze attraverso la formazione 32

permanente, la riflessione critica sull’esperienza e la ricerca. Progetta, svolge e partecipa ad attività di formazione. Promuove, attiva e partecipa alla ricerca e cura la diffusione dei risultati.” Nell’articolo successivo, il 12, si sottolinea inoltre che “L’infermiere riconosce il valore della ricerca, della sperimentazione clinica e assistenziale per l’evoluzione delle conoscenze e per i benefici sull’assistito.”

La ricerca infermieristica nasce nel momento in cui, mossi dalla curiosità di approfondire determinati argomenti, si è in grado di formulare dei quesiti che scaturiscono dalle attività del quotidiano. Per poter far ricerca è indispensabile però conoscere e seguire il METODO SCIENTIFICO (vedi figura 3) che consente di raggiungere una conoscenza della realtà oggettiva, verificabile e condivisibile attraverso la raccolta di dati empirici e la formulazione di teorie da vagliare.36 Tale metodica si compone di 5 principali fasi:

1. Identificazione e definizione del problema di ricerca

2. Formulazione dei metodi di ricerca

3. Raccolta ed analisi dei dati

4. Analisi dei dati

5. Pubblicazione e distribuzione dei risultati ottenuti

Cimarelli 5

Figura 3: Processo di ricerca (Geri LoBiondo Wood & Judith Haber 2004).

La ricerca infermieristica deve inoltre rispettare alcuni requisiti fondamentali:

– deve focalizzarsi su una variabile che ha come obiettivo quello di perfezionare l’assistenza al cliente

– deve contribuire allo sviluppo della teoria e del corpo di conoscenze scientifiche del Nursing

– un problema di ricerca appartiene all’infermieristica quando gli infermieri hanno l’accesso e il controllo sul fenomeno che si è studiato

– un infermiere ricercatore deve avere una mentalità creativa, indagatrice, inquisitoria. 34

5 OBIETTIVI E SCOPO DELLO STUDIO:

Questo elaborato si propone di studiare l’efficacia di farmaci vegetali nella terapia dell’artrite sperimentale, in particolare l’effetto che l’Artocarpus Tonkinensis produce sulle cellule del sistema immunitario.

Insieme alla parte sperimentale ho voluto inoltre sottolineare come la ricerca scientifica sia di fondamentale importanza nella professione infermieristica in quanto con essa è possibile sviluppare e migliorare non solo l’assistenza al paziente ma anche approfondire le conoscenze dei meccanismi genetici e fisiologici che caratterizzano ogni individuo.

6 MATERIALI E METODI

6.1 SELEZIONE DEI CAMPIONI

Lo studio è stato condotto utilizzando topi wild type (WT) del ceppo C56B6, ai quali sono stati prelevati gli organi linfoidi, successivamente processati al fine di ottenere le cellule di interesse impiegate nello studio in vitro.

6.2 STUDIO FARMACOLOGICO IN VITRO

Le cellule murine dei topi WT sono state coltivate alla concentrazione di 1×106 cellule/ml in RPMI (Rosewell Park Memorial Institute 1640) con l’aggiunta del 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, L-glutamina 2,5 mM, HEPES 15 mM (tampone necessario a 35

mantenere un pH fisiologico), sodio piruvato 0,5 mM, glucosio 3,15 g/L (principale fonte energetica delle cellule), bicarbonato di sodio 1,2 g/L. Il siero è necessario per apportare i fattori di crescita e proteine quali l’albumina, la transferrina e le immunoglobuline. Gli antibiotici vengono utilizzati, generalmente a scopo preventivo, per evitare contaminazioni batteriche.

Le cellule sono state coltivate in incubatori necessari per mantenere condizioni microclimatiche costanti e favorevoli per la crescita cellulare: una temperatura di 37° C, un’umidità del 90% ed una concentrazione di CO2 del 5%.

Una volta messe in coltura, le cellule sono state attivate utilizzando l’anticorpo anti-CD3e (biosciences), precedentemente piastrato alla concentrazione di 10μg/ml in PBS, e l’anticorpo anti-CD28 (biosciences) alla concentrazione di 1μg/ml aggiunto al terreno di coltura. Il CD3 è un co-recettore delle cellule T, mentre il CD28 è una delle molecole espresse dai linfociti T la cui funzione è quella di contribuire alla loro attivazione. Le cellule sono state divise nei seguenti gruppi sperimentali:

1° GRUPPO: è il gruppo di controllo, si tratta di cellule attivate non trattate (NT);

2° GRUPPO: cellule attivate e trattate con AT (decotto derivato dalle foglie dell’ Artocarpus tonkinensis)

3°GRUPPO: cellule attivate e trattate con l’estratto etanolico derivato dall’ Artocarpus tonkinensis (E.E)

Abbiamo valutato gli eventuali effetti delle sostanze dopo 24h e 48h di coltura.

Successivamente abbiamo effettuato la conta cellulare ad esclusione vitale, utilizzando la camera di Burker ed il colorante trypan blue, in modo da valutare 36

un’eventuale variazione tra il numero di cellule piastrate inizialmente e il numero di cellule dopo il trattamento con le sostanze in esame.

6.3 STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA

Le cellule vengono lavate con PBS e pellettate con l’utilizzo di una centrifuga refrigerata. Il pellet cellulare viene lisato con RLT buffer con l’aggiunta di β-mercaptoetanolo e omogeneizzato mediante passaggi in siringa con ago da 21 Gauge. L’estrazione dell’ RNA è stata effettuata utilizzando: RNA Mini Kit (Qiagen).

Si procede con la quantizzazione dell’ RNA ottenuto, mediante l’utilizzo di uno spettofotometro (NANODROP).

6.3.1 RETROTRASCRIZIONE DELL RNA

Dopo l’estrazione, l’RNA totale viene retrotrascritto tramite il kit Takara primer script.

Il processo avviene mediante l’utilizzo di un termociclatore alle seguenti temperature: 37

 37per 15 minuti, tempo durante il quale inizia il processo della trascrizione inversa dell’ RNA a cDNA

 85per 5 secondi, tempo necessario per l’inattivazione della trascrizione inversa e per il suo trattamento.

6.3.2 REAL TIME

Dopo aver eseguito la trascrizione inversa, è stata effettuata una RealTime PCR (Applied Biosistems) utilizzando i protocolli standard della TaqMan Gene Expression assays. I livelli di mRNA dell’ IL-17A sono stati valutati utilizzando le sonde: Mm00439618_m1: IL-17a mouse FAM-MGB assay e Mm99999915_g1: GapdH mouse FAM-MGB per GAPDH (housekeeping gene). 38

 8. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA

1F. Iebba et al.:L’artrite reumatoide come modello di malattia genetica multifattoriale: una rassegna della letteratura Recenti Prog Med 2011; 102: 175-182

2 Kasper Braunwald Et All: Principi Di Medicina Interna Volume II 16° Edizione

3Chiara de Waure, Antonella Sferrazza, et all Epidemiologia e burden of disease dell’artrite reumatoide. Italian Journal Of Public Health; IJPH – Year 8, Volume 7, Number 2, Suppl. 2, 2010.

4 Di Joseph P. Iannotti, Richard D. Parke, Netter Atlante Di Anatomia Fisiopatologia E Clinica Edra Masson, 23 Apr 2015

5R.Borlotti. L’artrite Reumatoide Nell’anziano. 2004

6Iain B. McInnes, F.R.C.P., Ph.D., and Georg Schett, M.D. The Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis N Engl J Med 2011; 365:2205-2219December 8, 2011

7 Stastny, P., E. Ball, M. Kahn, N. Olsen, T. Pincus, and X. Gao. 1988. HLA-DR4 and other genetic markers in rheumatoid arthritis. Br. J. Rheumatol. 27:132.

8 Rosloniec EF1, Brand DD, Myers LK, Esaki Y, Whittington KB, Zaller DM, Woods A, Stuart JM, Kang AH. Induction of autoimmune arthritis in HLA-DR4 (DRB1*0401) transgenic mice by immunization with human and bovine type II collagen. J Immunol. 1998 Mar 15;160(6):2573-8).

9 Wordsworth, B. P., J. S. Lanchbury, L. I. Sakkas, K. I. Welsh, G. S. Panayi, and J. I. Bell. 1989. HLA-DR4 subtype frequencies in rheumatoid arthritis indicate that DRB1 is the major susceptibility locus within the HLA class II region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10049.

10 Gary S. Firestein: Etiology and Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis

11 Karen H Costenbader and Elizabeth W Karlson. Epstein–Barr virus and rheumatoid arthritis: is there a link? Review; Arthritis Research & Therapy 2006, 8:204 (doi:10.1186/ar1893) 42

12 WHO World Health Organization Fact Sheet – Rubella; Fact sheet N°367 Updated August 2015;

13Cann Alan J., Elementi di virologia molecolare, Casa Editrice Ambrosiana, ISBN 8840813632;

14 Weyand CM1, Goronzy JJ. Pathogenesis of rheumatoid arthritis. Med Clin North Am. 1997 Jan;81(1):29-55:

15 Assil Saleh, MD, MPH, Rheumatoid Arthritis: Novel Strategies For An Old Problem

16 Assil Saleh, MD, MPh. Rheumatoid Arthritis: Deseases Pathogenesis

17 Jennifer G. Worrall, Artriti e Reumatismi

18 Maria Lucia Specchia, Silvio Capizzi,et all I T A L I A N J O U R N A L O F P U B L I C H E A L T H Aspetti gestionali, organizzativi e di accesso relativi al trattamento con tocilizumab nel contesto di cura italiano IJPH – Year 8, Volume 7, Number 2, Suppl. 2, 2010

19 Richard A. Lehne : Pharmacology For Nursing Care, Saunders- Elsevier

20Sito internet: https://it.wikipedia.org/wiki/Glucocorticoidi_di_sintesi

21Sito internet: http://www.amrer.it/materiali_artrite_reumatoide/DMARS.pdf

22Sito internet: http://www.salute.gov.it Rapporto Mondiale dell’OMS sulle malattie non trasmissibili

23Sito internet: https://www.ars.toscana.it/aree-dintervento/.di…/malattie-croniche

24Sito internet: http://www.naturmed.unimi.itWho_Linee_Guida_Consumatore:

25 Who Traditional Medicine Strategy 2014-2023

26Little C1, Parsons T. Herbal Therapy For Treating Rheumatoid Arthritis.

27 Sito internet: http://www.zenon.it/oms-medicine-complementari-tradizionali-malattie-croniche. Per l’OMS, solo la medicina Tradizionale ci salverà dalle malattie croniche

28 Sito internet: http://www.ilcambiamento.it/medicina/oms_

29 Valéria de Jesus Pereira1, Maria Auxiliadora Coelho Kaplan1 Artocarpus: Um Gênero Exótico de Grande Bioatividade 43

30 Ngoc DD1, Catrina AI,et all Inhibition by Artocarpus tonkinensis of the development of collagen-induced arthritis in rats.

31 Dang DT1, Eriste E et all. A novel anti-inflammatory compound, artonkin-4′-O-glucoside, from the leaves of Artocarpus tonkinensis suppresses experimentally induced arthritis.

32Sito internet: La prevalenza delle cronicità servizi.salute.toscana.it

33 Sito internet: http://www.ipasvi.it accordo stato regioni malattie reumatiche

34 Sito internet: http://www.associazioneitalianacasemanager.it

35 Sito internet: http://www.ipasvi.roma.it/archivio_news

363636 La ricerca infermieristica: tra realtà e utopia Hematology Meeting Reports 2008;


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