Approfondimenti recenti sul possibile ruolo dell’autofagia nelle malattie autoimmunitarie

Riassunto

L’incidenza delle patologie autoimmunitarie è in aumento in tutto il mondo. Ciò ha stimolato l’interesse sulla loro eziopatogenesi, causata da una complessa interazione di fattori genetici ed ambientali.  Con l’avvento degli studi di genome-wide linkage, di gene candidato e genome wide association, sono stati scoperti polimorfismi a rischio nei geni correlati all’autofagia in molte condizioni autoimmuni il chè suggerisce un possibile contributo dell’autofagia alla loro patogenesi.  L’autofagia rappresenta il principale processo catabolico mediato dai lisosomi usato dalle cellule eucariotiche ed è strettamente regolato da proteine che appartengono alla famiglia Atg.  La funzione dell’autofagia è stata ben caratterizzata in vari tessuti e sistemi, ma il suo ruolo nella regolazione dei sistemi immuni innato ed adattivo è stato scoperto solo di recente.  Gioca un ruolo fondamentale nella modulazione della selezione timocitaria e nella generazione del repertorio dei linfociti T partecipando alla presentazione intracellulare dell’antigene con molecole MHC di classe-II da parte delle cellule epiteliali timiche.  Inoltre, la generazione di topi con assenza di geni specificamente correlati all’autofagia induce molte alterazioni immunologiche, inclusi difetti dei compartimenti B e T e dell’attivazione delle cellule T.  In questa rassegna riportiamo evidenze sul ruolo dell’autofagia in autoimmunità e discutiamo la sua rilevanza nella patogenesi di queste malattie.  Infine mettiamo in luce il fatto che ricerche future possono svelare nuovi potenziali bersagli terapeutici per il trattamento di questa categoria di disordini attraverso la modulazione della via autofagica.

Introduzione               

L’insorgenza clinica della malattia è spesso preceduta da un lungo periodo preclinico come è esemplificato al meglio dalla storia naturale del diabete mellito dipendente dall’insulina [diabete di tipo I (T1D)]. Strategie predittive dell’insorgenza della malattia puntano quindi ad evidenziare anormalità immunologiche nel sangue periferico come l’evidenziazione di anticorpi circolanti insieme alla valutazione dei fattori genetici di rischio negli screening familiari e di popolazione.                Le informazioni a riguardo dell’eziopatogenesi dell’autoimmunità sono aumentate rapidamente con gli avanzamenti in immunogenetica degli anni passati. Come è stato recentemente mostrato da studi di mappatura genetica, molteplici loci genici sono responsabili della T1D, del lupus eritematoso sistemico (SLE), sclerosi multipla (MS), malattia infiammatoria dell’intestino (IBD), artrite reumatoide (RA) e psoriasi.                Negli ultimi anni sono stati scoperti nuovi meccanismi che regolano la tolleranza immunologica e l’autoimmunità con una focalizzazione specifica sui geni che controllano le vie proteolitiche coinvolte nella presentazione dell’antigene. Nel processo autoimmune, le risposte immuni sono generate contro peptidi che sono presentati nel contesto delle molecole dell’MHC di classe I. La processazione e la presentazione di MHC e antigene portano alla formazione di questi complessi nel reticolo endoplasmatico (ER). Peptidi di legame a MHC di classe I sono prodotti nel citoplasma dalla degradazione di proteine endogene; ciò avviene attraverso proteasi tra cui il proteasoma multicatalitico. I trasportatori associati con la processazione dell’antigene (TAP1 e TAP2) trasportano alcuni intermedi proteolitici nell’ER per una ulteriore processazione da parte di amminopeptidasi dell’ER, ERAP1 ed ERAP2, prima di essere associate a molecole MHC di classe I. Sono stati condotti studi di GWA e il follow up di casi controllo che hanno portato all’identificazione di SNP ERAP in molte condizioni autoimmuni. Uno stretto legame è stato trovato in un certo numero di malattie, tra cui la spondilite anchilosante (AS), MS, malattia di Crohn (CD) e T1D. Inoltre la relazione tra vie proteolitiche diverse è stata messa in luce come componenti processati nel sistema ubiquitina/proteasoma probabilmente ingaggiati in vie autofagiche. Molti studi genetici hanno già mostrato il coinvolgimento di vari polimorfismi di rischio in geni correlati all’autofagia nel processo autoimmune. Queste conoscenze di base sottolineano la rilevanza nel chiarire il possibile ruolo patogenetico delle vie proteolitiche come la via autofagica in autoimmunità. In questa rassegna riportiamo evidenze recenti sul ruolo dell’autofagia in autoimmunità e discutiamo la sua rilevanza nella patogenesi di queste malattie. Infine mettiamo in luce che la ricerca sull’autofagia può svelare nuovi potenziali bersagli terapeutici in questa categoria di disordini.

 E’ stata riportata per primo negli anni ’70 l’associazione di alleli genetici comuni con la regione del complesso maggiore d’istocompatibilità (MHC) che codifica per gli antigeni leucocitari umani (HLA) in condizioni autoimmuni dove sono coinvolti molteplici sottotipi. Oltre agli HLA, molti polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) probabilmente caratterizzano la patogenesi dell’autoimmunità come dimostrato dai successivi studi di genome wide-linkage, candidate gene, e genome wide association (GWA). Geni candidati di suscettibilità comune coinvolti nella regolazione immune includono cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) che sopprime l’attivazione dei linfociti T, forkhead box protein 3 (FoxP3) che gioca un ruolo nella differenziazione delle cellule T regolatorie (Treg), il gene IL-2Rα/CD25 che influenza lo sviluppo e la funzione delle Treg, ed il gene tumor necrosis factor alpha (TNF-α). Tra gli altri, la protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 (PTPN22), che codifica per la proteina lymphoid tyrosine phosphatase (Lyp), influenza la via di segnale del T cell receptor (TCR).

                E’ riconosciuto generalmente che l’autoimmunità deriva dalla “fuga” di cellule T autoreattive dal timo alla periferia in età prenatale a causa della mancata espressione promiscua nel timo di antigeni specifici degli organi periferici. Nel processo autoimmune le cellule T helper (Th), che evadono i meccanismi di auto-tolleranza, iniziano l’infiammazione e forniscono aiuto alle cellule B autoreattive attraverso citochine pro-infiammatorie. L’attivazione, espansione e successiva differenziazione delle cellule B mature in plasmacellule che producono autoanticorpi contribuiscono ulteriormente al danno tessutale.

                Le malattie autoimmunitarie sono un gruppo eterogeneo di “disordini complessi comuni” che colpiscono vari organi e sistemi. La loro patogenesi è caratterizzata da un’interazione di fattori genetici ed ambientali. Negli ultimi 30 anni è stato riportato un aumento dell’incidenza di disordini autoimmuni in tutto il mondo; in toto colpiscono il 5% circa della popolazione e frequentemente pazienti affetti da una malattia autoimmune hanno una aumentata suscettibilità a sviluppare altre manifestazioni autoimmuni.

2. Che cos’è l’autofagia

L’autofagia consiste nell’intrappolamento di materiale intra-citoplasmatico in vescicole con membrana doppia definiti come autofagosomi. La fusione dell’autofagosoma con i lisosomi causa la generazione di autolisosomi in cui il materiale sequestrato e la membrana interna sono degradati da idrolasi lisosomiali.                L’autofagia è regolata geneticamente e la sua morfologia è stata ben caratterizzata sia nei lieviti che nei mammiferi. Il processo autofagico è regolato da proteine che appartengono alla famiglia autophagy-related gene (Atg). Le proteine Atg sono evolutivamente conservate dai lieviti ai mammiferi. Ciascuna di esse esercita una funzione specifica durante il processo autofagico che consiste di quattro fasi, dalla formazione dell’autofagosoma, il suo successivo allungamento, attrarre i lisosomi ed infine la fusione con essi.

L’origine della membrana autofagosomale (membrana di isolamento) non è stata chiarita completamente. Contribuiscono alla formazione dell’autofagosoma membrane di molte strutture ed organelli, come il ER, mitocondri, l’apparato di Golgi, i compartimenti post-Golgi, le membrane nucleari e plasmatica. Tuttavia il problema non è al momento chiarito completamente dal momento che marcatori proteici selettivi degli organelli appena citati vengono persi durante la formazione autofagosomale. 

Nelle cellule eucariotiche sono disponibili due meccanismi per degradare i componenti intracellulari: il proteasoma e l’autofagia. L’autofagia costituisce il principale processo catabolico regolato mediato dai lisosomi usato dalle cellule eucariotiche. Possono essere distinte tre forme di autofagia sulla base della loro funzione cellulare e modalità di trasporto di depositi citoplasmatici ai lisosomi: autofagia mediata da chaperoni, microautofagia, e macroautofagia (che sarà affrontata in questa rassegna e chiamata semplicemente autofagia). Questo meccanismo è presente ad un basso livello basale in tutti i tipi cellulari.

Il processo dell’autofagia avviene attraverso l’inattivazione del mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1), definito anche come “bersaglio meccanicistico della rapamicina”, che è una chinasi conservata a serina/treonina sensore di nutrienti.  Questa inattivazione avviene attraverso l’ipossia, la fame ed il trattamento farmacologico con rapamicina.  Nonostante ciò, sono stati riportati altri meccanismi indipendenti oltre a mTORC1.

3. La via autofagica               

Il modellamento, l’espansione e l’adesione della membrana autofagosomale avviene grazie a due sistemi di coniugazione simili all’ubiquitina che inducono la formazione dei complessi Atg5-Atg12-Atg16L e la coniugazione di light chain-3 (LC3) associata al microtubulo (il cui ortologo nei lieviti è Atg8) con fosfatidiletanolammina (PE).                Il processo autofagico è bloccato da piccole molecole, soprattutto amminoacidi, rilasciate in conseguenza della degradazione dei depositi autofagosomiali da parte di idrolasi lisosomiali, attraverso la riattivazione di mTOR.                L’autofagia può essere regolata da altri fattori. Durante la crescita e lo sviluppo, il processo è attivato differenzialmente. Più specificamente, l’autofagia è più attiva durante il periodo neonatale, quando si ferma il passaggio di nutrienti dalla madre al neonato; all’opposto una riduzione dell’autofagia è stata associata all’invecchiamento. I nutrienti possono intervenire nella modulazione dell’autofagia. L’assenza di fattori di crescita o amminoacidi, in particolare leucina, rappresenta condizioni che promuovono l’autofagia. Gli amminoacidi non hanno bisogno di ormoni per regolare tale processo dinamico ed il tipo di amminoacidi coinvolti dipende da cellule e tessuti.

                L’autofagia è modulata anche da altre molecole, incluse l’antibiotico rapamicina, che sopprime il regolatore negativo dell’autofagia mTOR inducendo così il processo autofagico (vedi sopra). Inoltre, l’espressione di geni dell’autofagia potrebbe essere modulata dal TNF-α e da insulin-like growth factor-1 (IGF-1) nelle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) ottenute da placche aterosclerotiche. In aggiunta, TNF-α favorisce il processo autofagico nelle VSMC.

                Autofagia e geni appartenenti alla famiglia Atg sono coinvolti in molte funzioni cellulari negli eucarioti, tra cui il ricambio delle proteine e di interi organelli, nella prevenzione della deposizione intracellulare di proteine anormali o male assemblate, nei processi di differenziazione e di rimodellamento tessutale e nell’eliminazione di patogeni intracellulari. L’autofagia esercita funzioni in condizioni che richiedono energia ed uso di nutrienti intracellulari, come dimostrato dalla sua induzione in condizioni di ipossia e stress metabolico od ossidativo. In queste condizioni, l’autofagia dimostra un rapido aumento, permettendo il rilascio di substrati usati per il mantenimento dei livelli di ATP e la nuova sintesi di proteine che giocano un ruolo fondamentale nell’adattamento allo stress.

                Più specificamente, il trasferimento sequenziale di Atg12 ad Atg7 e, conseguentemente, di Atg10 (rispettivamente, enzimi simili a E1 ed E2), consente il legame di Atg12 ad Atg5 usando il residuo glicinico C-terminale dello stesso Atg5. Il complesso formato da Atg12 e Atg5 interagisce con la proteina autophagy related 16-like 1 (Atg16L1) che forma il complesso Atg16L che non è associato permanentemente con la membrana dell’autosoma in formazione. Il complesso Atg16L consente, attraverso il coinvolgimento di altre proteine Atg (Atg7 e Atg3), la coniugazione finale di LC3-I con PE per produrre LC3-II lipidata e localizzata nell’autofagosoma che è incorporato nella membrana in formazione dell’autofagosoma. Il complesso Atg16L (complesso Atg12-Atg5-Atg16) lascia la membrana esterna dell’autofagosoma dopo la sua formazione, mentre PE è staccato da Atg4 da LC3-II per essere riciclato. LC3-II rimane un marcatore autofagosomico localizzato nella superficie del citosol dell’autofagosoma. Inoltre LC3 è coinvolto nel legame della proteina adattatrice p62, che attraverso interazioni stabilite con strutture poliubiquitinate, promuove il loro catabolismo (Fig. 1).

                Nelle cellule di mammifero la formazione dell’autofagosoma è strettamente regolato dal complesso Unc51-like kinase 1 (ULK1) attivato dalla dissociazione di mTORC1 che è costituito da mTOR, regulatory associated protein of mTOR (raptor), proline-rich AKT substrate 40 kDa (PRAS40), G protein β subunit-like protein (GβL/mLST8) e DEP domain containing mTOR-interacting protein (DEPTOR)(vedi sopra)(Fig.1). Il complesso ULK1 è formato da ULK1/2, Atg13, Atg101 e la chinasi d’adesione focale family interacting protein of 200 Kda (FIP200). Il complesso ULK1 si sposta all’interno del sito di formazione autofagosomale. Successivamente questo evento porta alla defosforilazione di Atg13, ULK1 e ULK2 inducendo l’attivazione di queste ultime due chinasi. Successivamente l’attivazione di ULK1 e ULK2 causa la fosforilazione di FIP200 e Atg13. In condizioni di deprivazione di energia cellulare, l’autofagia è attivata da AMP-activated protein kinase (AMPK), la cui attivazione a sua volta è indotta da Liver kinase B1 (LKB1 kinase). L’attivazione di AMPK induce la sua associazione con ULK1 per formare AMPK/ULK1. Questa interazione gioca un ruolo critico nel processo autofagico attraverso la fosforilazione di raptor da parte di AMPK che blocca l’effetto inibitorio esercitato da mTOR sul complesso ULK. La nucleazione e l’assemblaggio della membrana del fagoforo avviene attraverso il coinvolgimento del complesso phosphatidylinositol 3-kinase/vacuolar protein sorting 34 (PI3K3/Vps34), la cui regolazione positiva è indotta da autophagy-related 14 (Atg14L), endophilin B1/UV radiation resistance-associated gene (Bif-1/UVRAG) e da autophagy/Beclin-1 regulator 1 (Ambra 1), mentre è soppresso da Rubicon/UVRAG. L’inibizione dell’autofagia avviene anche attraverso il legame di B cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) a Beclin-1. L’attivazione dell’autofagia implica la fosforilazione di Ambra 1 da parte di ULK1, causando ciò la dissociazione di Ambra 1 e del complesso PI3K3 dal citoscheletro ed inducendo la traslocazione di questo complesso nel ER. La fornitura dei lipidi necessari per l’allungamento della membrana avviene attraverso il reclutamento della proteina transmembrana ad attraversamento multiplo mAtg9 nell’autofagosoma in crescita. Inoltre mAtg9 è implicato nel reclutamento di effettori nel fagoforo (anche chiamato membrana d’isolamento).

Fig. 1. La via autofagica in cellule di mammifero. L'autofagia richiede l'inattivazione del mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1), che costituisce una chinasi conservata a serina/treonina che percepisce i nutrienti. L'inattivazione avviene tramite ipossia, fame e trattamento farmacologico con rapamicina, anche se sono stati descritti meccanismi indipendenti diversi da mTORC1. In cellule di mammifero la formazione dell'autofagosoma è modulata dal complesso d'attivazione ULK1 indotto dalla dissociazione di mTORC1. mTORC1 è costituito da mTOR, Raptor, PRAS40, GbetaL/mLST8 e DEPTOR. Il complesso ULK1 è formato da ULK1/2, Atg13, Atg101 e FIP200. Il complesso ULK1 trasloca nel sito di formazione dell'autofagosoma. Questo evento induce la defosforilazione di Atg13, ULK1 e ULK2 causando l'attivazione di queste due ultime chinasi. Successivamente, l'attivazione di ULK1 e ULK2 induce la fosforilazione di FIP200 e Atg13. In comdizione di ridotta energia cellulare, l'autofagia è attivata da AMPK, la cui attivazione è a sua volta indotta da lla chinasi LKB1. L'attivazione di AMPK induce la sua associazione con ULK1 formando AMPK/ULK1. Questa interazione gioca un ruolo critico nell'attivazione del processo autofagico attraverso la fosforilazione di RAPTOR dovuta ad AMPK che blocca l'effetto inibitorio esercitato da mTOR sul complesso ULK. Il complesso PI3K3/Vps34 consente la nucleazione e l'assemblamento della membrana di isolamento. Il complesso PI3K3/Vps34 è modulato positivamente da Atg14L, Bif-1/UVRAG ed Ambra 1, mentre è bloccato da Rubicon/UVRAG. L'inibizione dell'autofagia avviene anche attraverso il legame tra Bcl-2 e Beclin-1. L'attivazione dell'autofagia richiede la fosforilazione di Ambra 1 da parte di ULK1, causando la dissociazione di Ambra 1 e del complesso PI3K3 dal citoscheletro ed inducendo la traslocazione di questo complesso nel ER. Il reclutamento della proteina ad attraversamento multiplo mAtg9 nell'autofagosoma in sviluppo è coinvolto nella fornitura dei lipidi necessari per l'allungamento della membrana. Il modellamento, l'espansione e l'adesione della membrana autofagosomale sono mediate da due sistemi di coniugazione simili all'ubiquitina che inducono la formazione del complesso Atg5-Atg12-Atg16L e la coniugazione di di LC3 con PE. Atg12 si lega ad Atg5 usando il residuo di glicina C-terminale dello stesso Atg5 generando un complesso che interagisce con Atg16L1 formando il complesso Atg16L. Quest'ultimo non è permanentemente associato con la membrana dell'autofagosoma in crescita. Il complesso Atg16L consente, attraverso il coinvolgimento di Atg7 e Atg3, la coniugazione finale di LC3-I con PE producendo LC3-II che è incorporato nella membrana autofagosomale in formazione. Dopo la formazione dell'autofagosoma, il complesso Atg16L (complesso Atg12-Atg5-Atg16) lascia la membrana esterna, mentre PE è da Atg4 staccato da LC3-II per essere riciclato. LC3-II rimane un marcatore autofagosomiale sulla superficie citosolica dell'autofagosoma. LC3 è anche coinvolto nel legame della proteina adattatrice p62, che attraverso interazioni stabilite con strutture poliubiquitinate, promuove il loro catabolismo.

Fig. 1. La via autofagica in cellule di mammifero. L’autofagia richiede l’inattivazione del mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1), che costituisce una chinasi conservata a serina/treonina che percepisce i nutrienti. L’inattivazione avviene tramite ipossia, fame e trattamento farmacologico con rapamicina, anche se sono stati descritti meccanismi indipendenti diversi da mTORC1. In cellule di mammifero la formazione dell’autofagosoma è modulata dal complesso d’attivazione ULK1 indotto dalla dissociazione di mTORC1. mTORC1 è costituito da mTOR, Raptor, PRAS40, GbetaL/mLST8 e DEPTOR. Il complesso ULK1 è formato da ULK1/2, Atg13, Atg101 e FIP200. Il complesso ULK1 trasloca nel sito di formazione dell’autofagosoma. Questo evento induce la defosforilazione di Atg13, ULK1 e ULK2 causando l’attivazione di queste due ultime chinasi. Successivamente, l’attivazione di ULK1 e ULK2 induce la fosforilazione di FIP200 e Atg13. In comdizione di ridotta energia cellulare, l’autofagia è attivata da AMPK, la cui attivazione è a sua volta indotta da lla chinasi LKB1. L’attivazione di AMPK induce la sua associazione con ULK1 formando AMPK/ULK1. Questa interazione gioca un ruolo critico nell’attivazione del processo autofagico attraverso la fosforilazione di RAPTOR dovuta ad AMPK che blocca l’effetto inibitorio esercitato da mTOR sul complesso ULK. Il complesso PI3K3/Vps34 consente la nucleazione e l’assemblamento della membrana di isolamento. Il complesso PI3K3/Vps34 è modulato positivamente da Atg14L, Bif-1/UVRAG ed Ambra 1, mentre è bloccato da Rubicon/UVRAG. L’inibizione dell’autofagia avviene anche attraverso il legame tra Bcl-2 e Beclin-1. L’attivazione dell’autofagia richiede la fosforilazione di Ambra 1 da parte di ULK1, causando la dissociazione di Ambra 1 e del complesso PI3K3 dal citoscheletro ed inducendo la traslocazione di questo complesso nel ER. Il reclutamento della proteina ad attraversamento multiplo mAtg9 nell’autofagosoma in sviluppo è coinvolto nella fornitura dei lipidi necessari per l’allungamento della membrana. Il modellamento, l’espansione e l’adesione della membrana autofagosomale sono mediate da due sistemi di coniugazione simili all’ubiquitina che inducono la formazione del complesso Atg5-Atg12-Atg16L e la coniugazione di di LC3 con PE. Atg12 si lega ad Atg5 usando il residuo di glicina C-terminale dello stesso Atg5 generando un complesso che interagisce con Atg16L1 formando il complesso Atg16L. Quest’ultimo non è permanentemente associato con la membrana dell’autofagosoma in crescita. Il complesso Atg16L consente, attraverso il coinvolgimento di Atg7 e Atg3, la coniugazione finale di LC3-I con PE producendo LC3-II che è incorporato nella membrana autofagosomale in formazione. Dopo la formazione dell’autofagosoma, il complesso Atg16L (complesso Atg12-Atg5-Atg16) lascia la membrana esterna, mentre PE è da Atg4 staccato da LC3-II per essere riciclato. LC3-II rimane un marcatore autofagosomiale sulla superficie citosolica dell’autofagosoma. LC3 è anche coinvolto nel legame della proteina adattatrice p62, che attraverso interazioni stabilite con strutture poliubiquitinate, promuove il loro catabolismo.

4. Fisiologia e fisiopatologia del processo autofagico

L’autofagia gioca un ruolo critico nel mantenimento dell’organizzazione cellulare e nel controllo di qualità delle proteine intracellulari, come dimostrato dall’accumulo di proteine ubiquitinate in epatociti e cellule neurali con deficienza di autofagia che causa difetti della funzione cellulare e tossicità. Il processo autofagico difettivo è legato a patologie gravi, tra cui disordini metabolici, infezioni, malattie neurodegenerative e cancro. Recentemente è stato scoperto che la sua funzione, coinvolta nell’identificazione ed eliminazione di patogeni intracellulari, gioca un ruolo fondamentale anche nella regolazione dell’immunità innata ed adattiva, influenzando infiammazione, sopravvivenza linfocitaria, omeostasi linfocitaria e differenziazione.

4.1. Autofagia e sviluppo linfocitario               

                La funzione dell’autofagia è stata caratterizzata in vari tessuti e sistemi, ma il suo ruolo nella regolazione del sistema immune innato ed adattivo è stato scoperto solo di recente.

                Già nel 1997 è stato dimostrato che l’inibizione chimica del processo autofagico induceva il blocco della presentazione di un antigene citoplasmatico espresso ectopicamente ristretta per MHC di classe II da parte di macrofagi e linfociti B; in seguito risultati simili sono stati ottenuti per antigeni tumorali trasfettati, per epitopi virali espressi fisiologicamente e per antigeni citoplasmatici associati all’autofagosoma.  Nel timo l’autofagia è attivata costitutivamente indipendentemente dalle condizioni metaboliche.  L’autofagia potrebbe partecipare fortemente alla via di presentazione dell’MHC di classe II attraverso il rilascio di auto-antigeni citoplasmatici nei compartimenti di MHC di classe II.  Questa ipotesi è sostenuta dal profilo di colocalizzazione intracellulare della molecola marcatore specifico dell’autofagia LC3-II, con i compartimenti lisosomali positivi per H2-DM dove avviene la formazione dei complessi dell’MHC di classe-II più il class II-associated invariant chain peptide (CLIP).  Questi dati sono stati dimostrati sia in vitro in linee di cellule epiteliali timiche corticali (cTEC) e midollari (mTEC) che in situ  attraverso l’analisi di criosezioni di timi ottenuti da topi di 1 giorno.  Il coinvolgimento del processo autofagico nella presentazione degli antigeni intracellulari con  le molecole MHC di classe II da parte delle TEC e delle cellule dendritiche gioca un ruolo fondamentale nella modulazione della selezione timica e nella generazione del repertorio dei linfociti T.  L’ipotesi, messa in campo da Nedjic e coll., che sostiene il ruolo essenziale dell’autofagia nell’induzione della selezione negativa delle cellule T e nello sviluppo della autotolleranza, è stata ulteriormente chiarita attraverso la generazione del modello murino di topi Atg7 f/f K14-Cre.  In questo modello murino l’autofagia è selettivamente soppressa nelle TEC attraverso la delezione del gene Atg7 usando il sistema Cre-loxP.  Il topo Atg7 f/f K14-Cre non sviluppa autoimmunità senza mostrare cambiamenti significativi nella differenziazione dei linfociti T e B.  Inoltre l’analisi dell’infiammazione tessutale delle sezioni colorate con H&E (ematossilina eosina) non hanno mostrato differenze significative tra topi che esprimono ATG7 (ATG7 f/f) e topi che non lo esprimono (topi ATG 7 f/f K14-Cre).  Questi risultati sono in contrasto con l’ipotesi proposta da Nedjic, anche se le differenze nel disegno sperimentale dei due studi possono aver generato interferenze che spiegano i diversi risultati ottenuti.

                Lo studio di topi chimerici portatori dell’allele Atg7-null hanno rivelato anormalità nella generazione di peptidi legati all’MHC di classe II nelle TEC, associate con selezione positiva alterata che è risultata non funzionante in alcune cellule T CD4+, ed aumentata in altre.

                L’induzione dell’autofagia è anche fondamentale per assicurare la proliferazione, il mantenimento e la sopravvivenza dei linfociti T (vedi più sotto).  Durante l’attivazione delle cellule Th effettrici, l’autofagia è aumentata permettendo il controllo del metabolismo energetico, la cui richiesta risulta aumentata in cellule T attivate.  In accordo a ciò, il blocco del processo autofagico tramite l’uso della leupeptina ed NH4Cl o 3-metiladenina induce una forte riduzione della sintesi dell’interleuchina-2 (IL-2), interferon-γ (IFN-γ) e della proliferazione delle cellule T.

                Pua e coll., hanno rivelato la presenza di autofagia in linfociti T di topo CD4+ e CD8+ primari e che questo meccanismo potrebbe essere promosso stimolando le cellule per due giorni con anti-CD3 solubile.  La generazione di topi chimerici Atg5-/- hanno mostrato che, nonostante la maturazione timocitaria e l’espressione dei livelli di TCR non erano influenzati, la deficienza di Atg5 induce molte alterazioni immunologiche, incluse una forte riduzione dei compartimenti di linfociti T e B periferici, con una diminuzione più forte di cellule CD8+ rispetto alle cellule CD4+.  Questo ha portato a speculare un ruolo dell’autofagia nei linfociti T maturi in quanto causa una ridotta proliferazione in seguito a stimolazione del TCR con anti-CD3.  Nonostante l’autofagia fosse indotta in cellule T proliferanti in vitro , come dimostrato dalla trasmissione al microscopio elettronico e immunoblotting per LC3, è possibile che Atg5 giochi un ruolo nella generazione dell’autofagosoma indipendentemente dalla propria funzione nella proliferazione delle cellule T, forse cooperando con death receptor adaptor protein (FADD).  La successiva analisi del tasso di apoptosi dei linfociti T Atg5-/- ha rivelato una forte diminuzione della sopravvivenza nella popolazione di cellule T CD8+.  E’ stato ipotizzato che tale grave riduzione potrebbe essere causata dalla presenza di una condizione di scarsità di nutrienti e/o citochine che le cellule CD8+ incontrano dopo la loro uscita dal timo o di una possibile influenza di Atg5 sulla sopravvivenza attraverso l’interazione con molecole anti-apoptotiche.  Quest’ultima ipotesi è supportata dalla dimostrazione di interazione reciproca tra autofagia ed apoptosi.  Molti studi hanno valutato il ruolo di Beclin-1 (l’ortologo di Atg6 dei lieviti nei mammiferi) che è coinvolto nell’inizio dell’isolamento della generazione di membrana (vedi sopra).  Queste investigazioni hanno riportato il coinvolgimento di questa proteina autofagica nello sviluppo delle cellule T nel timo usando topi transgenici per Beclin-1-GFP (proteina fluorescente verde).  La sopravvivenza delle cellule T era strettamente correlata al controllo di qualità e al ricambio dei mitocondri, come dimostrato in cellule T murine deficienti di Atg5 o Atg7.

                Inoltre l’attivazione delle cellule T risulta alterata da difetti nel processo autofagico.  Topi geneticamente senza Atg3 o Atg7 erano incapaci di eliminare ER danneggiato e ciò causava la persistenza di questi organelli danneggiati ed un difettivo rilascio di calcio (Ca2+) dall’ER, che è essenziale per l’attivazione delle cellule T.

                In aggiunta, l’autofagia partecipa alla regolazione della sopravvivenza ed allo sviluppo dei linfociti B.  La deficienza di Atg5 influenza il compartimento delle cellule B, giocando un ruolo critico durante le fasi finali dello sviluppo da linfociti pro a pre-B nel midollo osseo e nel mantenimento nei tessuti periferici della popolazione di cellule B B-1A.  Quest’ultima sottosezione linfocitaria include le cellule B B-1A che costituiscono parte del sistema immune innato.  Un’altra proteina essenziale per il processo autofagico è costituita da Beclin-1 (vedi sopra).  Topi deficienti per Beclin-1 muoiono precocemente durante lo sviluppo embrionale, rendendo impossibile lo studio della deficienza di Beclin-1 in tessuti selettivi.  Il ruolo di Beclin-1 nelle cellule T e B è stato investigato usando chimere Rag1-/- (recombination activating gene 1-/-) deficienti di Beclin-1 ed in vitro la differenziazione di cellule staminali embrionali.  La deficienza di Beclin-1 induce una forte diminuzione della cellularità timica causata da un mantenimento difettivo dei progenitori timici sia in vivo che in vitro.  Il compartimento delle cellule T periferiche nelle chimere Rag1-/- deficienti di Beclin-1 e della proliferazione di cellule T in vitro non erano alterate dall’assenza di Beclin-1, nonostante sia stato osservato un ridotto numero di autofagosomi in linfociti T periferici.  Queste osservazioni supportano l’ipotesi che Beclin-1 è coinvolta in uno stadio precoce dello sviluppo linfocitario, distinto dal ruolo di altre proteine autofagiche come Atg5, che è coinvolta nelle fasi finali dello sviluppo delle cellule B nel midollo osseo.

5. Autofagia ed immunità innata

     L’autofagia è coinvolta nella protezione innata contro i patogeni (batteri intracellulari e virus), anche se alcuni batteri (tra cui Listeria monocytogenes, Shigella e Rickettsia conorii) sono capaci di evadere dai fagosomi. Invece il Mycobacterium (M.) tuberculosis è capace di sopravvivere nel fagosoma stesso dove, regolandolo, può vivere e proliferare. Si sa che le citochine possono modulare l’autofagia; in questo ambito le citochine Th2 (IL-4 e IL-13) costituiscono inibitori dell’autofagia che agiscono da stimolatori della PI3K di tipo I, mentre il trattamento farmacologico con IFN-γ permette l’eliminazione del M. tuberculosis attraverso la promozione dell’autofagia nei macrofagi.

Anche la stimolazione con vitamina D promuove l’attivazione dell’autofagia contro il M. tuberculosis nei macrofagi umani inducendo le cathelicidin (peptidi multifunzionali dell’immunità innata) ed attivando il promotore dei geni Atg5 e Beclin-1.

         Recentemente, è stata riportata la presenza di una regolazione reciproca tra autofagia ed inflammasoma; questo costituisce il processo molecolare coinvolto nella protezione dell’immunità innata inducendo la maturazione di citochine pro-infiammatorie come IL-1β.

              Quando l’autofagia è bloccata, l’attività dell’inflammasoma è aumentata, e viceversa. Inoltre è stata ipotizzata una regolazione negativa tra autofagia ed inflammasoma. Durante l’infiammazione, questa modulazione negativa potrebbe mirare a restaurare una condizione di omeostasi. All’inizio, l’autofagia è promossa dall’attivazione dell’inflammasoma attraverso il legame di Ras-like small G-protein (RalB) a exocyst complex 84 (Exo84). Questo legame crea una piattaforma per la generazione della membrana d’isolamento del fagosoma. Poi avviene la ubiquitinazione di ASC [(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruiting domain (CARD)], promossa dall’inflammasoma attivato. ASC ubiquitinata e l’inflammasoma ubiquitinato sono incorporati dall’autofagosoma attraverso p62, una molecola adattatrice dell’autofagia capace di identificare proteine ubiquitinate e partecipare alla loro degradazione durante il processo autofagico (vedi sopra). Il fenomeno è negativamente modulato da p62, che limita la sintesi di IL-1β attraverso la promozione della distruzione dell’inflammasoma.                L’eliminazione funzionale del gene ATG16L1 usando siRNA abroga l’autofagia di cellule HeLa in S. Typhimurium. Cellule controllo e senza ATG16L1 erano caratterizzate da tassi di influenza sull’autofagia simili a quelli ottenuti in fibroblasti embrionali di topo Atg5+/+ e Atg-/- rispettivamente.

                E’ stato dimostrato che eliminare geneticamente i geni Atg causa molte alterazioni immunologiche, inclusa una aumentata suscettibilità ad infezioni virali e batteriche in diversi modelli animali; più in dettaglio, dall’infezione mortale di Salmonella (S.) typhimurium in Dictyostelium e Caenorhabditis elegans, al virus della stomatite vescicolare e a L. monocytogenes in Drosophila. L’eliminazione genetica di Atg5 induce una suscettibilità più elevata all’infezione da L. monocytogenes e Toxoplasma gondii in macrofagi e neutrofili murini, e al virus Sindbis nei neuroni.

L’eliminazione funzionale del gene ATG16L1 usando siRNA abroga l’autofagia di cellule HeLa in S. Typhimurium.  Cellule controllo e senza ATG16L1 erano caratterizzate da tassi di influenza sull’autofagia  simili a quelli ottenuti in fibroblasti embrionali di topo Atg5+/+ e Atg-/- rispettivamente

5.1. Polimorfismi dei geni autofagici e suscettibilità alle infezioni               

Molte ricerche hanno studiato la correlazione tra la variante ATG16L1 rs2241880 e la suscettibilità alle infezioni, riportando dati opposti a seconda del tipo cellulare studiato. In particolare i fibroblasti deficienti di ATG16L1 trasdotte con la variante ATG16L1 rs2241880 non ha mostrato nessuna differenza nella suscettibilità all’infezione da Salmonella rispetto ai fibroblasti trasdotti con ATG16L1 normale. Un piccolo studio condotto nella popolazione Europea ha riportato che la variante ATG16L1 rs2241880 è correlata con un alto tasso di infezione all’Helicobacter pylori, mentre non è stata rilevata nessuna correlazione tra la variante ATG16L2 (rs11235604) e suscettibilità all’infezione da M. tuberculosis in pazienti TB Indonesiani.

                Molti studi hanno anche investigato la correlazione tra genotipi immunity-related GTPase family M (IRGM) e tubercolosi. Più specificamente, il genotipo IRGM -261 TT conferisce una protezione relativa contro il M. tuberculosis, ma non contro le infezioni da M. bovis e M. africanum. Tra i polimorfismi IRGM -1208 A/G (rs4958842), -1161 C/T (rs4958843) e -947 C/T (rs4958846), solo le ultime due varianti esercitavano un ruolo protettivo contro la tubercolosi in un campione di popolazione Iraniana, mentre in pazienti TB Cinesi la IRGM -1208 A/G era associata a ridotta suscettibilità alla tubercolosi polmonare. Inoltre, il polimorfismo IRGM C/T (rs10065172) era associato a suscettibilità alla TB in Afro Americani.

                La variante T300A di ATG16L1 (rs2241880), caratterizzata dalla sostituzione dell’amminoacido treonina in posizione 300 con una alanina mostra alte frequenze in popolazioni umane, raggiungendo il 55% di alleli nella gente da antenati Europei, mentre il 20 e 40% di alleli in altre popolazioni. Tale alta frequenza potrebbe essere dovuta al ruolo protettivo della variante contro le infezioni di patogeni facoltativi intracellulari, conoscenza supportata da una ridotta invasione di Salmonella nelle cellule epiteliali intestinali (IEC), anche se la presenza di questo SNP, così come di altri polimorfismi, può conferire un rischio più alto di insorgenza di malattie autoimmuni (vedi dopo).

6. Autofagia e disordini autoimmuni

In accordo ad una ipotesi recente, l’autoimmunità è indotta in caso di aumentata autofagia per una aumentata sopravvivenza e ridotta apoptosi di linfociti auto-reattivi. Ci sono molte evidenze che supportano il coinvolgimento dell’autofagia in alcune condizioni autoimmuni incluse la scoperta di polimorfismi in geni correlati all’autofagia.  Sono particolarmente studiati disordini come la SLE, le malattie infiammatorie dell’intestino (IBD), RA, psoriasi, vitiligo, e sclerosi multipla.

6.1 Lupus eritematoso sistemico

L’autofagia in linfociti murini è stata studiata da Gros e colleghi. Questi ricercatori hanno osservato una disregolazione dell’attività autofagica in due modelli murini con aplotipi diversi [MRLlpr/lpr e (NZB/NZW)F1] tendenti allo sviluppo di lupus.  Più in dettaglio, i linfociti periferici nel lupus mostravano un accumulo significativo di vacuoli autofagici rispetto ai topi normali, mentre questa anormalità non si osservava in cellule T timiche.  Questa osservazione era in accordo con dati precedenti e ciò supporta l’ipotesi di un ruolo maggiormente critico giocato dall’autofagia nell’omeostasi dei linfociti T periferici in paragone con le fasi immature più precoci dello sviluppo delle cellule T.

L’analisi della morfologia delle cellule T nel SLE ha rivelato la presenza di megamitocondri. Questa alterazione potrebbe essere dovuta a difetti nel rinnovamento dei mitocondri da autofagia (definita mitofagia). Cellule T murine ed umane del SLE mostravano un aumento del numero degli autofagosomi ed un aumento dell’autofagia. Tutte queste evidenze rappresentano pietre miliari sull’omeostasi patologica degli organelli nel SLE. L’incremento dell’autofagia, che potrebbe essere dovuta ad autoanticorpi circolanti, è stata osservata prima dell’insorgenza del SLE e potrebbe promuovere la sopravvivenza di cellule T autoreattive in questi disordini.

A riguardo, l’attivazione del sistema immune innato potrebbe essere indotto dalle alterazioni mitocondriali. In particolare, la persistente iperpolarizzazione mitocondriale (MHP) promuoveva la necrosi delle cellule T nel SLE dopo la loro stimolazione, in paragone a cellule T normali caratterizzate dal successivo rilascio di detriti di cellule T che attivavano il sistema immune innato, soprattutto le cellule dendritiche plasmacitoidi.

Le cellule T da pazienti con SLE erano caratterizzati da un più alto numero di vacuoli autofagici, come dimostrato dalla quantizzazione con microscopio elettronico, rispetto a controlli sani e a 3 pazienti affetti da disordini autoimmuni diversi dal lupus (due con vasculiti ed uno con sindrome di Sjogren primaria). La disregolazione autofagica osservata in due topi tendenti al lupus è stata quindi confermata in cellule T di soggetti con SLE.

Studi di GWA hanno identificato due SNP vicino ai locus genici Atg5 che erano associati con l’inizio e lo sviluppo di SLE in Caucasici: Atg5 SNP rs6568431 (popolazione dell’UK) e rs2245214 (popolazioni US e Svedese).

6.2 Malattia infiammatoria dell’intestino               

                Le due principali forme di malattia infiammatoria dell’intestino (IBD) idiopatica sono costituite dalla malattia di Crohn (CD) e dalla colite ulcerativa (UC). All’insorgenza dell’IBD contribuiscono sia fattori di rischio genetici che non genetici. Soggetti CD omozigoti per l’allele di rischio ATG16L1 mostrano molte alterazioni immunologiche, incluse una difettiva degradazione autofagica, alterata presentazione di antigeni batterici a linfociti T CD4+ e difetti nella formazione di granuli delle cellule Paneth. Nel CD, cellule di Paneth deficienti per Atg16L1 mostravano una espressione più elevata di citochine infiammatorie. In aggiunta, fibroblasti murini embrionali (MEF) mutanti Atg16L1HM, che esprimono un livello più basso di proteina Atg16L1, mostravano una ridotta induzione di autofagosomi dopo affamamento, ed ancora più evidente dopo trattamento con rapamicina. Inoltre, topi deficienti di Atg16L1 o Atg5 mostravano alterazioni simili nella secrezione operata da cellule Paneth, che giocano un ruolo essenziale nell’intestino attraverso la secrezione di granuli contenenti lisozima e peptidi antimicrobici. L’analisi di campioni ileo-colici ottenuti da pazienti CD portatori dell’allele di rischio ATG16L1 ha rivelato la presenza di anomalie delle cellule Paneth simili a quelle osservate nei topi Atg16L1HM.

Molti studi genetici hanno riportato il coinvolgimento di vari polimorfismi di rischio in geni correlati all’autofagia nella suscettibilità a IBD e CD in particolare. Tra questi geni ULK1, Atg4 e ATG16L1 che codificano per proteine del macchinario centrale, IRGM e leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) che codificano per proteine regolatorie, nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) e Toll-like receptor 4 (TLR4) che codificano per pattern recognition receptors (PRR) coinvolti nell’induzione dell’autofagia.

  Solo di recente è stato scoperto il coinvolgimento dell’autofagia nella suscettibilità all’IBD. Il gene di mammifero ATG16L1, localizzato nell’esone 8 del cromosoma 6 2q37.1, rappresenta l’omologo di ATG16 dei lieviti ed attraverso la generazione di un complesso con Atg5 e Atg12 è coinvolto nell’autofagia (vedi sopra). La sua espressione è stata trovata nei macrofagi, colon e piccolo intestino, linfociti ed epitelio intestinale. L’espressione più elevata di ATG16L1 è stata riportata nei linfociti T, mentre le cellule B mostravano una espressione più forte in confronto a cellule mononucleari ed RNS placentare di controllo. Tra molte varianti di splicing, rs2241880 del gene ATG16L1 rappresenta una variante di suscettibilità per l’insorgenza del CD.

                Hampe e colleghi hanno condotto uno studio di GWA genotipizzando 19779 SNP in 735 soggetti affetti da CD e 368 controlli Tedeschi identificando rs2241880 dell’ATG16L1 come variante di suscettibilità per il CD. E’ stata osservata mancanza di associazione tra la variante ATG16L1 rs2241880 e la UC. L’associazione della malattia di rs2241880 con la suscettibilità al CD è stata replicata in molte coorti indipendenti di adulti Europei, mentre investigazioni preliminari hanno riportato risultati conflittuali su pazienti CD pediatrici. L’associazione di mallattia di rs2241880 è stata confermata in un campione caso-controllo del UK, in una coorte pediatrica Tedesca di 152 bambini e 253 adulti donatori di sangue usando una saggio pre-disegnato di genotipizzazione di SNP, ed in una popolazione Portoghese composta di 511 pazienti CD e 652 controlli (studio GOIA II). In quest’ultima investigazione, è stata osservata l’associazione di ATG16L1 rs2241880 e la variante IRGM rs13361189 con il coinvolgimento ileale, ileo-colico e del tratto digestivo superiore. Nonostante ciò l’analisi del livello d’espressione ATG16L1 si mostrava essenzialmente inalterato in ampie biopsie intestinali da pazienti CD in paragone a normale tessuto colico. I ricercatori hanno anche trovato un rischio aumentato di CD in portatori sia dell’allele G rs2241880 che delle mutazioni di NOD2/CARD15 (nucleotide-binding oligomerization domain 2/caspase recruitment domain-containing protein 15), anche se non sono state osservate evidenze di epistasi.

    Lo studio caso-controllo condotto dal gruppo di Amre ha confermato l’associazione tra CD e variante ATG16L1 rs2441880 in una coorte pediatrica costituita da 289 bambini CD Canadesi e 290 controlli. Bambini portatori di genotipo GG esibivano un rischio 3 volte più alto di sviluppare la malattia rispetto a omozigoti AA normali ed in più l’associazione con questo SNP era selettivo per la malattia ileale. Lo studio ha riportato anche una frequenza più alta della variante IRGM rs10065172 in pazienti CD Canadesi in paragone a controlli sani, ma questa differenza non raggiungeva la significatività statistica.

Gli SNP in IRGM, un altro gene correlato all’autofagia, sono stati trovati associati a suscettibilità per il CD (vedi sotto). Più in dettaglio, nello studio condotto dal gruppo di Glas sei SNP IRGM (rs13371189, rs10065172, rs4958847, rs1000113, rs931058 e rs11747270) sono stati genotipizzati in 817 pazienti CD Caucasici, 283 pazienti con colite ulcerativa (UC) e 961 controlli sani. L’analisi ha dimostrato l’associazione suscettibilità CD con rs13371189, rs10065172 e rs 1000113. Nessuno degli SNP IRGM investigati ha rivelato tramite analisi genotipo-fenotipo associazione con uno specifico fenotipo IBD o coinvolgimento CD ileale. Quest’ultimo risultato era in contrasto sia con il recente studio condotto da Latiano et al., che mostrava un’associazione di varianti IRGM con CD fistolizzata, sia con l’investigazione portata avanti da Roberts e colleghi, che ha dimostrato una correlazione con CD ileale in una piccola coorte di Nuova Zelandesi.

   La suscettibilità genetica all’IBD era diversa in vari gruppi etnici. Pochi studi hanno riportato la relazione tra geni di suscettibilità all’IBD Caucasica (IRGM, NOD2, DGL5, SCL22A4, SCL22A5 e ATG16L1) e suscettibilità a CD in popolazioni Asiatiche.

Uno studio recente condotto da Moon e colleghi ha investigato se le varianti nel gene IRGM potrebbe conferire suscettibilità genetica a CD o UC in una popolazione Coreana. Più specificamente, tre SNP (rs72553867, rs10065172 e rs4958847) ed un locus di rischio (rs12654043) all’interno di IRGM sono stati genotipizzati in un gruppo totale di 510 pazienti IBD Coreani (253 soggetti affetti da CD e 257 da UC) e 520 controlli sani non correlati. La suscettibilità a CD era significativamente associata alla variante IRGM rs10065172 nella popolazione Asiatica analizzata; è stata osservata una relazione tra IRGM rs72553867 e suscettibilità al CD. Inoltre l’SNP IRGM rs10065172 conferiva un forte rischio per lo sviluppo di CD in pazienti più giovani alla diagnosi (< 20 anni) o pazienti maschi. Nessuna associazione significativa è stata trovata tra SNP IRGM (rs72553867, rs10065172, rs4958847 e rs12654043) e suscettibilità alla UC nella popolazione Coreana, in accordo con la meta-analisi di studi GWA sull’UC condotta su 6687 pazienti e 19718 controlli sani attuata da Anderson e colleghi.

Recentemente una meta-analisi in grande scala di 71 loci di suscettibilità CD è stata condotta in una popolazione Giapponese (1311 casi e 6585 controlli) da Hirano e colleghi, che ha riportato differenze genetiche in loci di suscettibilità CD tra le popolazioni Giapponesi ed Europee. Più in dettaglio, IRGM (rs7714584) e ATG16L1 (rs3792109) non esercitavano alcun effetto genetico significativo, mentre NOD2 (rs2076756) era assente nella popolazione Giapponese. Studi precedenti condotti su gruppi di pazienti CD Giapponesi hanno riportato una mancanza di associazione di IRGM rs10065172 con CD, mentre nessuna associazione è stata osservata tra IRGM rs4958847 ed rs13361189 con questa condizione autoimmune.

L’associazione di NOD2, ATG16L1 e IRGM con CD è stata recentemente investigata in Afro-Americani, che rappresentano una popolazione mista di antenati dell’Africa dell’ovest ed Europei. Sono stati genotipizzati un totale di 354 pazienti CD e 354 controlli sani correlati etnicamente. CD era associato con ATG16L1 rs2241880 (T300A) ed entrambi gli eterozigoti Thr/Ala così come gli omozigoti Ala/Ala mostravano rischio genotipico relativo significativamente più elevato. Tra altri geni correlati all’autofagia, il CD era significativamente associato a NOD2 (rs2066847), mentre nessuna associazione si osservava con tre varianti Africane ancestrali NOD2 non sinonime (rs35285618, rs5743278, rs5743279) né con varianti IRGM (rs4958847, rs13361189, rs10065172).

La meta-analisi condotta da Umeno et al., ha confermato che diciassette loci di suscettibilità sono in comune tra CD e UC, suggerendo il coinvolgimento dell’autofagia in entrambe queste patologie, anche se con un effetto più debole nella UC. In aggiunta, l’associazione con UC è stata trovata per gli SNP ATG16L1 (rs2241880, rs10210302 e rs3828309), LRRK2-MUC19 (rs11175593) e IRGM (rs4958847).

A proposito dell’UC, è stata riportata una tendenza all’associazione con UC per l’SNP IRGM rs11747270, mentre la meta-analisi condotta da Palomino-Morales e colleghi ha dimostrato un’associazione di due SNP IRGM (rs13361189 e rs4958847) con l’UC.

6.3. Artrite Reumatoide

L’RA rappresenta un disordine infiammatorio cronico, la cui patogenesi è causata da fattori genetici, ormonali ed ambientali.

Un recente lavoro mette in luce il ruolo critico dell’autofagia nella distruzione delle articolazioni mediata dal TNF-α nell’artrite sperimentale. Più in dettaglio, l’autofagia era attiva in osteoclasti di pazienti umani di RA come dimostrato dall’aumentata espressione di Atg7 e Beclin-1.  A causa del ruolo critico giocato dal TNF-α nella regolazione del riassorbimento osseo infiammatorio nell’artrite, gli effetti del TNF-α sul processo autofagico sono stati investigati in osteoclasti RA umani e murini.  Questa molecola promuoveva l’autofagia come dimostrato dall’aumento dell’espressione di Atg7 e Beclin-1 nell’RA umana ed in osteoclasti murini.  In sintonia con l’induzione di Atg7 e Beclin-1, anche il TNF-α promuoveva la conversione di LC3-I in LC3-II negli osteoclasti suggerendo un ruolo critico dell’autofagia nella patogenesi dell’RA attraverso la regolazione dell’infiammazione sinoviale e della degradazione dell’osso.  L’attivazione dell’autofagia, fortemente promossa dall’aumentata espressione di Beclin-1, induceva la differenziazione di monociti in osteoclasti maturi ed aumentava la capacità di riassorbimento degli osteoclasti murini.  In accordo a ciò, l’inibizione genetica o farmacologica dell’autofagia, attraverso la deficienza di Atg7 o il trattamento con Bafilomicina A1 rispettivamente, riduceva potentemente il riassorbimento osseo in vitro.  Questi risultati supportano il ruolo chiave dell’autofagia nelle applicazioni traslazionali nella malattia articolare indotta da TNF-α.  Infatti, l’inibizione dell’autofagia potrebbe rappresentare un approccio terapeutico adatto per prevenire il riassorbimento osseo nella patogenesi dell’RA.

Orozco e colleghi hanno investigato se gli SNP associati al SLE, erano associati anche all’RA. 3962 pazienti affetti da RA e 9275 individui sani del UK sono stati inclusi nello studio per essere genotipizzati.  Nonostante che l’SNP Atg5 rs6568431 dimostrava evidenza nominale per associazione con RA (p = 0.02), non veniva raggiunta una differenza statisticamente significativa dopo l’applicazione della correzione di Bonferroni.

Recentemente, il gruppo di Chatzikyriakidou ha investigato l’associazione dell’SNP ATG16L1 rs2241880 con l’RA in 134 pazienti Caucasici e 147 volontari sani, ma non è stata osservata nessuna differenza statisticamente significativa nella distribuzione dei “genotipi” e degli “alleli” rs2241880 tra i pazienti RA ed i controlli sani.

6.4. Psoriasi

La psoriasi rappresenta un disordine infiammatorio immuno-mediato che colpisce la cute con placche croniche. La sua eziologia è complessa ed è caratterizzata da una forte componente genetica.

La forma più comune è costituita dalla psoriasi vulgaris (PV), che rappresenta circa l’85% di tutti i casi. Dal momento che ATG16L1 gioca un ruolo fondamentale nel segnale immune e nell’attivazione cellulare, è stato investigato il possibile coinvolgimento di ATG16L1 nella suscettibilità alla psoriasi.  Il gruppo di Dourodis ha condotto uno studio caso controllo su 299 pazienti affetti da placche tipo psoriasi vulgaris (non-pustolose) e 241 controlli di origine Estone.  Sono stati genotipizzati sei SNP ATG16L1 (rs10210302, rs12994971, rs2241880, rs2241879, rs7587633 e rs13005285).  E’ stata riportata una frequenza significativamente più alta degli SNP rs10210302 CC, rs12994971 CC, rs2241880 AA, rs2241879 GG ed rs 13005285 TT nei pazienti rispetto ai controlli sani.

Un numero più alto di pazienti con psoriasi (da 10 a 30%) sono affetti anche da artrite psoriatica (PsA), che è caratterizzata dal coinvolgimento del tessuto sinoviale, da siti entesici e cute. In questi soggetti, la patologia può essere da lieve a grave e può causare deformità articolari simili a quelle osservate nell’RA.  Il profilo di espressione di ATG16L1 era alterato nelle cellule dendritiche (DC) della PsA il chè potrebbe essere una reazione verso infezione da (mico)batteri.

Una rara forma localizzata di psoriasi pustolosa è costituita dalla pustolosi palmo plantare (PPP). Questa forma condivide varie caratteristiche con altre forme pustolose di psoriasi, come la presenza di un infiltrato infiammatorio mononucleare e pustole spongiformi, ma la base genetica della PPP non è stata ancora delucidata.  Sono stati genotipizzati quattro SNP nel gene ATG16L1 (rs2241880, rs2241879, rs7587633 e rs13005285) in una coorte limitata di 38 pazienti affetti da PPP e 241 controlli sani di origine Estone, riportando una frequenza significativamente più elevata degli alleli rs2241880 G ed rs2241879 A nei pazienti rispetto ai controlli.

6.5. Vitiligo

La vitiligo costituisce una malattia pigmentosa della cute caratterizzata dalla presenza di maculo papule pigmentate dovute alla distruzione di melanociti. Nella vitiligo non segmentale (NSV), la depigmentazione è di solito bilaterale a cavallo della linea mediana, ma non necessariamente simmetrica.  L’eziologia deve essere ancora delucidata, tuttavia fattori genetici e ambientali sconosciuti sembrano contribuire alla patogenesi.

UVRAG è stato riconosciuto solo di recente come un gene associato all’autofagia che gioca un ruolo nella generazione dell’autofagosoma.  E’ localizzato nella sottoregione cromosomica 11q13 ed il suo nome è dovuto al ruolo nel fornire resistenza agli UV.  Il primo studio che ha investigato se le variazioni di UVRAG possano contribuire al rischio di NSV è stato condotto dal gruppo di Jeong nella popolazione Coreana.  225 pazienti NSV e 439 controlli sono stati inclusi nello studio.  Tra i cinque SNP UVRAG genotipizzati (l’SNP esonico rs636420, tre SNP intronici rs7933235, rs1380075 ed rs7111334, e l’SNP rs1458836 localizzato vicino alla regione 5’ del gene), due di loro (rs1458836 e rs7933235) dimostravano differenze genotipiche significative tra il gruppo dei pazienti NSV ed i controlli.  Quindi il gene UVRAG potrebbe rappresentare uno dei molti geni che gioca un ruolo nella suscettibilità poligenica alla NSV.

6.6. Sclerosi multipla

La sclerosi multipla (MS) è un disordine infiammatorio cronico che colpisce il sistema nervoso centrale (CNS) che è caratterizzato da demielinizzazione mediata da cellule T.

L’analisi dell’espressione di Atg5 è stata condotta sia in un modello murino di demielinizzazione autoimmune ottenuto immunizzando topi con glicoproteina mielinica oligodendrocitica (MOG), che nel sangue e nel tessuto cerebrale ottenuto da pazienti MS.  L’espressione di Atg5 era significativamente aumentata in cellule di sangue ottenute da topi EAE ed era correlata con la gravità clinica dell’EAE.  Nonostante che i livelli d’espressione del mRNA di Atg5 nelle cellule T non mostrassero nessuna differenza significativa tra pazienti con MS attiva recidivante-remittente (RRMS) in paragone ad individui con RRMS quiescente e controlli.

Il gruppo di Xu e colleghi hanno investigato il ruolo putativo di IRGM1 nella patogenesi dell’encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE) nei topi, un modello animale di MS, in cui EAE era indotta dalle iniezioni sottocutanee di proteina mielinica basica (MBP). IRGM1 rappresenta un fattore critico nell’EAE e nella progressione della MS.  La sua espressione era fortemente aumentata nelle lesioni da MS e nel CNS di topi con EAE indotta da MBP.  Topi IRGM1-/- erano resistenti all’EAE indotta da MBP; inoltre, cellule T CD4+ nel CNS e nella milza di topi IRGM1-/- mostravano una ridotta capacità proliferativa, aumentata apoptosi ed aumentata espressione di IFN-γ.  Quindi gli autori propongono che il blocco di IRGM1 potrebbe rappresentare una possibile strategia terapeutica per fermare la MS.

7. Considerazioni conclusive

L’autofagia è stata inizialmente investigata come processo coinvolto nella “sopravvivenza cellulare” ed oggi è riconosciuta come fondamentale nella fisiologia delle cellule eucariotiche. L’autofagia partecipa chiaramente allo sviluppo linfocitario, immunità innata e suscettibilità alle infezioni.  Come discusso prima evidenze recenti in scienza di base suggeriscono il ruolo dell’autofagia in molte condizioni autoimmuni.  Con l’avvento del genome-wide linkage, di studi di candidate gene association e GWA, sono stati scoperti molti polimorfismi in geni correlati all’autofagia in molte condizioni autoimmuni suggerendo il possibile contributo dell’autofagia alla loro eziopatogenesi.  Gli autoantigeni possono derivare dalla degradazione di proteine intracellulari come risultato di autofagia, contribuendo così all’inizio ed alla perpetuazione del processo autoimmune.  Quindi ci aspettiamo che ricerche future sull’autofagia possano portare alla scoperta di nuovi bersagli terapeutici che offrirebbero nuove opportunità di medicina personalizzata per il trattamento di condizioni autoimmuni.

Messaggi Finali

  • Fattori genetici ed ambientali sottolineano l’eziopatogenesi dell’autoimmunità.
  • L’autofagia gioca un ruolo critico nel mantenimento dell’omeostasi cellulare.
  • Evidenze recenti supportano il ruolo dell’autofagia nell’eziopatogenesi dell’autoimmunità.
  • Sono stati scoperti SNP di geni correlati all’autofagia in molte condizioni autoimmuni.
  • La ricerca sull’autofagia può portare alla scoperta di futuri bersagli terapeutici per l’autoimmunità.

(Tratto da Elena Gianchecchi, Domenico Vittorio Delfino, Alessandra Fierabracci, “Recent insights on the putative role of autophagy in autoimmune diseases”, Autoimmunity Reviews, 2014; 13:231-241)

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