Saluti da Polsi

Posted in Calabria, libri with tags , , on May 3, 2014 by Domenico Delfino

Donna Cuncetta

“…- E ca comu facivimu nui… cu chiji si campava!!!

Ma anche stavolta… un miracolo! Per la verità non intervenne la Vergine, ma un vecchio brigadiere della Benemerita il quale spesso aveva goduto dell’ospitalità e di qualche buon bicchiere di vino offerto da Donna Cuncetta e che – va detto per onor di cronaca – aveva capito che non si può fare di tutte le erbe un fascio!  Egli venuto a sapere che ci sarebbero stati dei sopralluoghi, la informò in tempo e lei potè così nascondere le varie casse di Peroni e i tanti fiaschi di vino fatto in casa, pronti all’uso per i “carovanieri” che comunque continuavano ad affluire al Santuario, assetati come sempre e desiderosi di rifocillarsi alla sua bottega…”

Polsi

(Tratto da Raffaele Leuzzi “Saluti da Polsi – scritti e ricordi tra le immagini”, presentazione di Mons. Giancarlo Maria Bregantini, Nuove Edizioni Barbaro di Caterina Di Pietro, 2006)

La regolazione metabolica da parte di Bcl-xL della N-alpha acetilazione delle proteine promuove la sopravvivenza cellulare

Posted in Biomedical Research with tags , , , on April 24, 2014 by Domenico Delfino

Riassunto

Esperimenti precedenti suggeriscono una connessione tra l’N-alpha acetilazione delle proteine e la sensibilità delle cellule ai segnali apoptotici.  Qui, descriviamo un saggio biochimico per evidenziare lo stato di acetilazione delle proteine e dimostrare che l’N-alpha acetilazione delle proteine è regolata dalla disponibilità di acetil-CoA.  Poiché si sa che la proteina antiapoptotica Bcl-xL influenza il metabolismo mitocondriale, abbiamo pensato che Bcl-xL fornisca un legame tra L’N-alpha acetilazione delle proteine e l’apoptosi.  Infatti, l’eccessiva espressione di Bcl-xL porta ad una riduzione dei livelli di acetil-CoA e della N-alpha acetilazione delle proteine nella cellula.  Questo effetto è indipendente da Bax o Bak, i partners riconosciuti di Bcl-xL.  I crescenti livelli cellulari di acetil-CoA grazie all’aggiunta di acetato o citrato restaurano l’N-alpha acetilazione delle proteine in cellule che esprimono Bcl-xL e conferiscono loro sensibilità agli stimoli apoptotici.  Proponiamo che l’acetil-CoA serva come molecola di segnale che accoppia la sensibilità all’apoptosi con il metabolismo attraverso la regolazione dell’N-alpha acetilazione.

Introduzione

Evidenze crescenti suggeriscono che specifiche alterazioni metaboliche associate con cellule tumorali  possono non essere accessorie alla loro trasformazione ma sono strumentali al loro potenziale tumorigenico mediando la proliferazione cellulare, la crescita, e la sopravvivenza.  Molti oncogeni e geni di soppressione tumorale che promuovono un’eccessiva proliferazione cellulare alterano anche i processi biosintetici (o anabolici).  Per esempio, l’espressione di Akt stimola la captazione del glucosio e la glicolisi, la via dei pentosofosfati, e la sintesi di acidi grassi.  L’espressione di c-Myc promuove il metabolismo della glutamina così come la biosintesi delle purine e delle pirimidine.  Inoltre, in studi di associazioni genetiche con il cancro sono stati identificati mutazioni nei geni che codificano gli enzimi.  Come fanno metaboliti specifici a contribuire all’aumentata proliferazione ed alla resistenza all’apoptosi in cellule tumorali rimane una domanda centrale senza risposta.

                Il proto-oncogene Bcl-xL ha un ruolo preminente nel promuovere la sopravvivenza cellulare e lo sviluppo tumorale.  E’ ben stabilito che Bcl-xL protegge  contro l’apoptosi legando direttamente Bax/Bak ed inibendo la permeabilizzazione mitocondriale mediata dall’oligomerizzazione di Bax/Bak.  Tuttavia, alcuni mutanti di Bcl-xL, come F131V/D133A e G148E, nonostante non siano capaci di legare Bax o Bak, mantengono il 70-80% di attività anti-apoptotica rispetto al Bcl-xL originale.  Curiosamente, è stato anche visto che Bcl-xL regola la respirazione mitocondriale ed il metabolismo.  Non è chiaro se la funzione metabolica di Bcl-xL contribuisca al proprio ruolo nel mediare la resistenza all’apoptosi.

                La nostra inaspettata identificazione di una acetiltransferasi N-terminale, Arrest defective 1 (dARD1), in uno screening genomico di RNA interference (RNAi) in cellule di Drosophila per regolatori apoptotici ci ha spinto ad ipotizzare che l’N-alpha acetilazione delle proteine, una delle principali modificazioni N-terminali, leghi il metabolismo cellulare all’induzione dell’apoptosi in cellule tumorali.  Dal momento che dARD1 è epistatico a diap1, che codifica un inibitore diretto delle caspasi in Drosophila, e ARD1 è necessario per l’attivazione caspasica in cellule di mammifero, il ruolo di ARD1 nel mediare l’attivazione caspasica è evolutivamente conservato.  Non è stato però ancora illustrato come ARD1 regola l’attivazione caspasica.

                In cellule di ma

mmifero, l’N-alpha acetilazione delle proteine è mediata da complessi proteici di N-acetiltransferasi altamente conservati (NatA, NatB, NatC, NatD e NatE).  Il complesso NatA consiste della subunità catalitica, Arrest Defective 1 (hNaa10p/ARD1), e dalla subunità ausiliaria, N-acetiltransferasi 1 (NAT1/hNaa15p/NATH), mentre NatB consiste della acetiltransferasi 3 N-terminale (hNaa20p/NAT3) e da mitochondrial distribution and morphology 20 (hNaa25p/Mdm20).  Nonostante i complessi Nat siano implicati nella regolazione della progressione del ciclo cellulare, proliferazione cellulare, e tumorigenesi, i meccanismi che connettono l’N-alpha acetilazione all’apparato proteico cellulare sono sconosciuti.  Recenti studi di N-acetiloma rivelano uno stato di acetilazione delle proteine incompleto.  Nonostante una visione comunemente accettata sia che l’acetilazione parziale risulta dalla natura degenerata delle sequenze N-terminali delle proteine, abbiamo considerato la possibilità che l’N-alpha acetilazione delle proteine possa essere regolata, essendo questa un’ipotesi alternativa non analizzata finora a causa di limitazioni tecniche.

                Qui, abbiamo sviluppato un approccio biochimico per valutare lo stato dei livelli endogeni della N-alpha acetilazione delle proteine.  Usando questo saggio, mostriamo che i livelli di N-alpha acetilazione delle proteine sono sensibili ad alterazioni del metabolismo e dell’espressione di Bcl-xL.  L’eccessiva espressione di Bcl-xL porta a ridotti livelli di acetil-CoA ed all’ipoacetilazione dell’estremità N-terminale delle proteine attraverso un meccanismo indipendente da Bax/Bak.  Al contrario, i fibroblasti embrionali di topo Bcl-x-/- mostrano livelli aumentati di acetil-CoA così come alti livelli di N-alpha acetilazione delle proteine.  La deficienza di N-alpha acetilazione delle proteine in cellule che esprimono Bcl-xL in eccesso contribuisce alla resistenza all’apoptosi dal momento che una produzione crescente di acetil-CoA può salvare questa deficienza in N-alpha acetilazione e sensibilizza le cellule Bcl-xL alla morte cellulare.  Il nostro studio suggerisce che la regolazione della disponibilità di acetil-CoA e dell’N-alpha acetilazione delle proteine possa fornire un meccanismo indipendente da Bax/Bak per la regolazione della sensibilità apoptotica da parte di Bcl-xL.

Discussione

La capacità di valutare rapidamente le modificazioni proteiche immunologiche è stata essenziale per esplorare la significatività e la regolazione di modificazioni postraslazionali multiple come la fosforilazione, la metilazione istonica, e l’acetilazione.  Dal momento che non esiste un anticorpo per la N-alpha acetilazione delle proteine, la capacità di valutare questa modificazione era severamente limitata.  A questo proposito, il saggio della subtiligasi come è stato descritto in questo studio fornisce un mezzo potente per consentirci di valutare rapidamente i livelli endogeni di N-alpha acetilazione delle proteine.  Usando questo saggio, abbiamo scoperto che lo stato di N-alpha acetilazione delle proteine è ridotto  nelle cellule che esprimono livelli eccessivi di Bcl-xL.  Inoltre, mostriamo che l’N-alpha acetilazione delle proteine è sensibile a cambiamenti acuti della disponibilità di acetil-CoA.

                I nostri studi legano direttamente un metabolita specifico, l’acetil-CoA, alla sensibilità apoptotica e sostengono un numero crescente di studi che descrivono un ruolo del metabolismo cellulare nel controllare l’apoptosi.  E’ interessante notare che i livelli cellulari di acetil-CoA sono sensibili allo stato di Bcl-xL con modalità indipendenti da Bax/Bak in quanto anche l’espressione dei mutanti di Bcl-xL che non sono capaci di legare Bax o Bak può influenzare i livelli di acetil-CoA allo stesso modo di ciò che avviene con Bcl-xL normale.  Hardwick e colleghi hanno dimostrato che questi mutanti di Bcl-xL preservano il 70-80% dell’attività antiapoptotica di Bcl-xL normale nonostante la loro incapacità di legare Bax o Bak.  Quindi, l’inibizione della produzione di acetil-CoA può fornire un meccanismo aggiuntivo di protezione da parte di Bcl-xL contro l’apoptosi in maniera indipendente da Bax/Bak.  Presi insieme, questi dati suggeriscono che Bcl-xL può proteggere contro l’apoptosi attraverso due meccanismi paralleli: Legando direttamente ed inibendo l’oligomerizzazione di Bax/Bak e regolando il metabolismo mitocondriale, che porta a livelli ridotti di acetil-CoA e di N-alpha acetilazione delle proteine.  Concludiamo che Bcl-xL integra il metabolismo con la resistenza apoptotica attraverso la modulazione dei livelli di acetil-CoA.

                Studi precedenti mostrano che Bcl-xL si lega direttamente al canale ionico dipendenti dal voltaggio (VDAC), un componente dei pori della permeabilità di transizione mitocondriale, che controllano lo scambio dei metaboliti mitocondriali.  E’ possibile che l’espressione di Bcl-xL possa alterare i livelli di acetil-CoA attraverso la regolazione della permeabilità della membrana mitocondriale.  Il carrier citrato (CiC), una proteina codificata nel nucleo localizzata nella membrana interna mitocondriale e membro della famiglia dei carrier mitocondriali, è responsabile dell’efflusso di acetil-CoA dal mitocondrio al citosol in forma di citrato.  Abbiamo scoperto che i livelli di citrato derivato da glucosio erano diminuiti di circa il 25% nelle cellule che esprimono Bcl-xL in eccesso rispetto ai controlli.  Questa riduzione dei livelli di citrato potrebbe spiegare l’osservata diminuzione di acetil-CoA in cellule che esprimono Bcl-xL in eccesso e contribuire alla funzione antiapoptotica di Bcl-xL.  Infatti, l’aggiunta di citrato a cellule che esprimono Bcl-xL in eccesso porta ad un aumento della N-alpha acetilazione delle proteine e della sensibilizzazione di queste cellule all’apoptosi.  Alterazioni della produzione di acetil-CoA si possono estendere ad altri contesti oncogenici oltre a quello che riguarda Bcl-xL.  Per esempio, è stato scoperto che i livelli di acetil-CoA derivato dal glucosio erano di circa il 20% più alti in cellule myc+/+ rispetto a cellule myc-/-.  Un aumento dei livelli di acetil-CoA potrebbe contribuire all’aumentata sensibilità apoptotica di cellule che esprimono c-MYC in eccesso.  Noi proponiamo che i livelli basali di acetil-CoA possano influenzare la soglia apoptotica in molteplici contesti oncogenici.

                La capacità di Bcl-xL di controllare i livelli di acetil-CoA e l’N-alpha acetilazione delle proteine fornisce un chiaro esempio attraverso cui il metabolismo è meccanicisticamente legato alla sensibilità apoptotica.  Il lievito mutante con perdita di funzione ard1 è specificamente difettivo nella risposta del fattore alpha ma non a quello dell’ a-factor, e ciò indica che lo stato dell’N-alpha acetilazione influenza un grande numero di proteine cellulari, noi speculiamo che la regolazione metabolica di questo processo eserciti il proprio controllo sui processi cellulari attraverso la regolazione di un gruppo (i) di proteine piuttosto che proteine singole.  Cellule di mammifero deficienti in ARD1 sono difettive nell’attivazione di caspasi-2, caspasi-3, e caspasi-9 in risposta al danno del DNA.  Consistente con ciò, l’N-alpha acetilazione di molteplici caspasi, tra cui caspasi-2, caspasi-3, e caspasi-9, è ridotta in cellule che esprimono Bcl-xL in eccesso.  E’ possibile che difetti di N-alpha acetilazione in molteplici caspasi, che forse regola negativamente la loro attivazione, contribuisca alla resistenza apoptotica delle cellule deficienti di ARD1 così come di quelle che esprimono in eccesso Bcl-xL.  Quindi, lo stato di N-alpha acetilazione delle proteine che sono coinvolte in una particolare via può collettivamente determinare uno specifico risultato fisiologico.  A questo proposito, il cofattore per i complessi NAT, acetil-CoA, serve come molecola di segnale che funziona come un’importante congiunzione tra il metabolismo e molteplici processi cellulari.

(Tratto da Caroline H. Yi, Heking Pan, ….Junying Yuan “Metabolic Regulation of N-Alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival”, Cell 146, 607-620, 2011, Elsevier)

Interazioni pianta medicinale-farmaco

Posted in libri with tags , , , , on April 8, 2014 by Domenico Delfino

BETULLA (Betulla)

Famiglia: Betulaceae.

Botanica: originaria dell’Eurasia.  Albero alto fino a 25 metri, i tronchi giovani sono bianchi, successivamente diventano scuri.  Le foglie sono da triangolari a romboidi.

Droga: foglie, corteccia.

Componenti: olio essenziale, saponine, flavonoidi (iperoside, quercitrina, glucosidi del kempferolo), tannini, resine.

Dosaggi e preparazioni: infuso, 1-2 cucchiaini di droga si infondono in 150 ml di acqua bollente, dopo circa 15 minuti si filtra.  Se ne assume, salvo diversa prescrizione, 3-4 tazze al giorno fra i pasti.

Indicazioni: foglie: edemi, sindromi premestruali, calcoli renali per le proprietà diuretiche, ma non demineralizzanti; corteccia: febbre per l’azione diaforetica e antipiretica; infa di betulla: depurativa e diuretica.

Interazioni: si consiglia di non utilizzarlo con farmaci ad azione diuretica per le sue proprietà, con i quali potrebbe dare origine ad un effetto additivo.

(Tratto da Maurizio Grandi, Giusi Denzio “Interazioni piante medicinali-farmaci – manuale pratico di consultazione”, Etnopharma, Intergraphica, 2007)

Viaggio di Bax da e per i mitocondri nel controllo dell’apoptosi

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on March 31, 2014 by Domenico Delfino

Le proteine antiapoptotiche Bcl-2 nei mitocondri inibiscono le proteine proapoptotiche, come Bax, che sono presenti principalmente nel citosol. Edlich et al., (2011) mostrano che Bax e Bcl-xL interagiscono sulla superficie mitocondriale e poi retrotraslocano nel citosol, prevenendo efficacemente la permeabilizzazione dei mitocondri indotta da Bax.

La via apoptotica di morte cellulare, nei suoi principi di base, è conservata tra i metazoi. Durante lo sviluppo, l’apoptosi modella organi e tessuti; durante la vita adulta, mantiene l’omeostasi dei tessuti. La resistenza all’apoptosi è una pietra angolare del cancro, mentre una morte cellulare programmata eccessiva è associata con malattie degenerative. L’apoptosi è controllata ed amplificata da una varietà di meccanismi, molti dei quali convergono nel rilascio di fattori proapoptotici dai mitocondri. Edlich et al (2011) adesso hanno scoperto come il traffico regolato dalla proteina proapoptotica Bax fuori dai mitocondri e dentro il citosol previene la permeabilizzazione mitocondriale, riconciliando modelli discordanti di come le proteine antiapoptotiche sulla superficie mitocondriale inibiscono le proteine proapoptotiche nel citosol.

                La permeabilizzazione dei mitocondri è controllata da proteine appartenenti alla famiglia Bcl-2, che è composta da membri pro- ed anti-apoptotici che condividono un’omologia in brevi tratti di aminoacidi chiamati domini Bcl-2 homology (BH). I membri che promuovono la sopravvivenza, inclusi Bcl-2, Bcl-xL ed Mcl-1, contengono domini BH 1-4 ed antagonizzano i membri pro-morte. Due tipi di membri pro-morte della famiglia Bcl-2 partecipano all’apoptosi. Le proteine multidominio, come Bax e Bak, contengono i domini BH 1-3 e mediano direttamente la permeabilizzazione mitocondriale, mentre si pensa che le proteine BH3-only (per es., Bid, Bim, Bad, etc) agiscano come sensori di stress cellulare. Nonostante i ruoli chiaramente definiti dei membri della famiglia Bcl-2, sono rimaste due domande principali: come vengono attivati i membri proapoptotici, e come fanno i membri antiapoptotici ad inibirli?

                Il modello semplificato di reostato, proposto per primo nei primi anni ’90, suggerisce che le proteine pro- ed anti-apoptotiche si controbilanciano direttamente l’una con l’altra, con la proteina più abbondante che determina se la cellula muore o sopravvive. A complicare questo modello c’è l’esistenza di due tipi di proteine BH3-only: gli “attivatori” che attivano direttamente i multi domini pro-apoptotici e i “sensibilizzatori” che neutralizzano l’inibizione anti-apoptotica delle proteine multidominio. Una versione modificata del modello del reostato postula che le proteine attivatrici BH3-only agiscono come recettori per le proteine proapoptotiche multidominio sulla membrana mitocondriale esterna (OM), mentre le proteine anti-apoptotiche agiscono come una spugna, succhiandole fuori dalla superficie mitocondriale. Un modello mutualmente esclusivo postula che le proteine antiapoptotiche leghino direttamente ed inibiscano Bax e Bak, con le molecole BH3-only che agiscono da inibitori degli inibitori. Quest’ultimo modello soffre di mancanze di evidenze che possano spiegare il paradosso spaziale di questa inibizione diretta: in circostanze normali, Bax è nel citosol, mentre Bcl-2 è sulla superficie mitocondriale. Con l’induzione dell’apoptosi, Bax si accumula sulla OM mitocondriale, va incontro a modificazioni conformazionali con esposizione del dominio ad elica, e innesca il rilascio, di citocromo c e di altri effettori proapoptotici.

                Per acquisire conoscenze sulla regolazione di Bax, Edlich et al, (2011) esaminano la localizzazione di una versione mutata di Bax che è costretta nella sua conformazione citosolica da ponti disolfuro ingegnerizzati. Sorprendentemente, la proteina mutante, che non interagisce con la proteina mitocondriale antiapoptotica Bcl-xL, si localizza nei mitocondri ma non induce apoptosi. A seguito di questa osservazione, gli autori si chiedono se Bax trasloca normalmente sulla superficie mitocondriale. Utilizzando la perdita di fluorescenza in foto-sbiancamento, monitorano la localizzazione di GFP-Bax nelle cellule e trovano che Bax viaggia dentro e fuori i mitocondri delle cellule sane. La presenza di proteine antiapoptotiche nella OM mitocondriale è necessaria per consentire la retrotraslocazione costitutiva di Bax nel citosol. E’ degno di nota che il ritmo di retrotraslocazione è quasi raddoppiato nelle cellule che esprimono quantità eccessive di Bcl-xL e richiede l’interazione fisica tra Bcl-xL e Bax. Una volta nel citosol, Bax ritorna velocemente nella sua forma monometrica, pronta a ritornare di nuovo sulla superficie mitocondriale. Edlich e collaboratori osservano un’accelerazione del ritmo di retrotraslocazione in coincidenza della espressione contemporanea di Bcl-xL e Bax. Allo stesso modo, l’inibitore Bcl-2/Bcl-xL ABT-737, così come le proteine BH3-only, alterano l’equilibrio tra Bax citosolico e mitocondriale riducendo la sua retrotraslocazione (figura 1).

Figura 1.  Movimenti di Bax in cellule sane e durante l'apoptosi.  In cellule sane, Bax inattivo viaggia continuamente tra i mitocondri ed il citosol.  In cellule sane la retrotraslocazione di Bax richiede l'interazione con una proteina antiapoptotica (Bcl-xL, Bcl-2, o Mcl1).  Insieme, queste due proteine lasciano la membrana mitocondriale esterna (OM).  Una volta nel citosol, il complesso si dissocia immediatamente.  Il processo di retrotraslocazione è stimolato dalle proteine antiapoptotiche Bcl-xL, Bcl-2, o Mcl1 ed è inibito da vMIA, ABT-737, e dalle proteine BH3-only.  Con l'induzione dell'apoptosi, Bax è direttamente stimolato dalle proteine attivanti BH3-only (per es., Bid, Bim, o Puma; freccia blu) ad esporre il proprio dominio C-terminale e ad inserirsi nella OM mitocondriale.  Durante questo processo, Bax espone un nuovo epitopo N-terminale (6A7), innescando la formazione di foci ed il rilascio di citocromo c.  Neutralizzare le proteine BH3-only (o piccole molecole inibitrici; rettangolo verde) può indirettamente attivare Bax attraverso il legame e l'inattivazione di proteine anti-apoptotiche.  Di conseguenza, Bax si accumula nella OM mitocondriale, dove acquista la propria conformazione attiva.

Figura 1. Movimenti di Bax in cellule sane e durante l’apoptosi. In cellule sane, Bax inattivo viaggia continuamente tra i mitocondri ed il citosol. In cellule sane la retrotraslocazione di Bax richiede l’interazione con una proteina antiapoptotica (Bcl-xL, Bcl-2, o Mcl1). Insieme, queste due proteine lasciano la membrana mitocondriale esterna (OM). Una volta nel citosol, il complesso si dissocia immediatamente. Il processo di retrotraslocazione è stimolato dalle proteine antiapoptotiche Bcl-xL, Bcl-2, o Mcl1 ed è inibito da vMIA, ABT-737, e dalle proteine BH3-only. Con l’induzione dell’apoptosi, Bax è direttamente stimolato dalle proteine attivanti BH3-only (per es., Bid, Bim, o Puma; freccia blu) ad esporre il proprio dominio C-terminale e ad inserirsi nella OM mitocondriale. Durante questo processo, Bax espone un nuovo epitopo N-terminale (6A7), innescando la formazione di foci ed il rilascio di citocromo c. Neutralizzare le proteine BH3-only (o piccole molecole inibitrici; rettangolo verde) può indirettamente attivare Bax attraverso il legame e l’inattivazione di proteine anti-apoptotiche. Di conseguenza, Bax si accumula nella OM mitocondriale, dove acquista la propria conformazione attiva.

                Questo nuovo studio fornisce un nuovo paradigma per comprendere la regolazione di Bax durante l’apoptosi, ma come le due categorie di proteine BH3-only antagonizzano la retrotraslocazione di Bax ad opera di Bcl-xL rimane un problema irrisolto. Una possibilità è che gli attivatori (per es., Bid e Bim) inibiscono direttamente la retrotraslocazione di Bax smascherando la sua elica α9 ed ancorando Bax nella OM mitocondriale. Al contrario, il sensibilizzatore (per es., Bad) potrebbe ostruire il legame tra Bax e Bcl-2. La relazione tra proteine proapoptotiche ed antiapoptotiche è parte della normale regolazione del traffico di Bax in cellule sane. In condizioni non-apoptotiche, l’equilibrio tra i gruppi citosolico e mitocondriale di Bax è mantenuto dalla retrotraslocazione dipendente da Bcl-xL. Durante l’apoptosi, tuttavia, può essere ribaltato dalle proteine BH3-only, che aumentano l’inserzione di Bax nella OM mitocondriale (Figura 1). Quindi, il modello di retrotraslocazione è un importante passo avanti, che concilia due modelli opposti di come proteine BH3-only, multidominio, e proteine anti-apoptotiche cooperino per dettare se una cellula viva o muoia.

                In aggiunta a questo nuovo modello, Edlich e colleghi hanno anche trovato che l’interazione debole tra Bcl-xL e Bax è sufficiente per estrarre Bcl-xL dalla OM mitocondriale e localizzarlo transitoriamente nel citosol. Ciò mette in luce una modificazione conformazionale non apprezzata che facilita la rimozione della proteina antiapoptotica dalla OM mitocondriale. E’ interessante che il ritmo della retrotraslocazione di Bcl-xL aumenta con il trattamento di ABT-737, e ciò solleva la possibilità che Bcl-xL inattivo possa essere prevalentemente citosolico. Sarà importante verificare se questa è una caratteristica comune degli antiapoptotici extramitocondriali, come Bcl-2/Bcl-xL localizzati nel reticolo endoplasmico (ER), e capire il meccanismo attraverso cui l’interazione con Bax inattiva il dominio transmembrana di Bcl-xL. Allo stesso modo, lo studio illustra che Bax inattivo si associa preferibilmente con la OM mitocondriale. E’ interessante che una frazione di Bax inattivo si associ alle membrane intracellulari, incluse i mitocondri ed il ER in cellule trasformate, ma non in epatociti primari. Comprendere come la trasformazione oncogenica influenzi il ritmo di attivazione della retrotraslocazione di Bax potrebbe aprire nuove prospettive all’apoptosi in cellule tumorali.

                Da una prospettiva teleologica, ci si potrebbe chiedere perché una cellula dovrebbe mantenere un flusso continuo di Bax da e verso i mitocondri ed il citosol. Un motivo potrebbe essere di imprimere alla cellule una rapida esecuzione di morte, posizionando Bax in una conformazione “pronta all’attacco” cosicchè cambiamenti minori nella cinetica di retrotraslocazione di Bax possano dolcemente indurre apoptosi. Un’altra possibilità è che Bax abbia funzioni aggiuntive che richiedono la sua presenza regolata nelle membrane cellulari. E’ interessante che Bax inattivo controlli eventi transitori di membrana come la fusione mitocondriale ed il mantenimento dei livelli di Ca2+ nel ER. In questi casi, tuttavia, Bax non può rimanere negli organelli senza attivarsi e promuovere apoptosi. Il modello di retrotraslocazione non fornisce solo un paradigma per capire come è regolata l’apoptosi, ma anche una piattaforma per integrare le diverse funzioni di Bax e di altri membri della famiglia Bcl-2.

(Tratto da Maria Eugenia Soriano e Luca Scorrano “Traveling Bax and forth from mitochondria to control apoptosis”, Cell 145:15-16, 2011)

La solitudine dei numeri uno

Posted in libri with tags , , , , on March 24, 2014 by Domenico Delfino

Gianluigi Buffon

Il superman ultrà

“…Un carattere particolare, difficile, insomma.  Chiuso e aperto al tempo stesso, estroverso ed introverso.  Lui che insegnava la calma ai compagni prima delle partite, e che mentre gli altri erano consumati dalla tensione, sonnecchiava tranquillo come Socrate, dopo si chiudeva nella dependance a saltabeccare come un tifoso indemoniato sugli spalti…”

(Tratto da Gianpaolo Santoro “La solitudine dei numeri uno”, manifestolibri, 2010)

Incontro tra l’estremità N-terminale e l’acetilazione

Posted in Biomedical Research with tags , , , , on March 17, 2014 by Domenico Delfino

La decisione del destino cellulare è strettamente legata allo stato energetico della cellula.  Yi et al. (2011) introducono un meccanismo per cui Bcl-xL abbassa la soglia dell’apoptosi attraverso la soppressione della produzione di acetil-CoA, che, a sua volta, sopprime l’N-alpha acetilazione importante per l’attivazione della proteasi proapoptotica caspasi-2.

 

Una decisione cellulare di morire per apoptosi, divenire quiescente, o proliferare è influenzata dalle condizioni metaboliche della cellula e del tessuto che la circonda.  Nei 10 anni passati, molteplici studi hanno stabilito un legame diretto tra queste vie cellulari critiche.  Per esempio, quando i livelli di glucosio fluttuano, le vie sensorie del glucosio trasducono segnali attraverso la chinasi Akt per alterare le modificazioni post-traslazionali e/o i livelli di espressione delle proteine della famiglia Bcl-2.  Ancora più complesso, dato il grande ventaglio di metaboliti nella cellula e l’intricato circuito metabolico di cui si nutrono, è stata la delucidazione delle interazioni tra piccoli metaboliti e le vie di segnale del destino cellulare.  Yi et al adesso dimostrano che la potenza antiapoptotica della proteina Bcl-xL origina in parte dalla sua capacità di abbassare i livelli di acetil-CoA, un substrato di proteine acetiltransferasiche (figura 1).  Ciò determina una diminuita N-alpha acetilazione di molteplici regolatori apoptotici, tra cui le caspasi ed il membro proapoptotico della famiglia Bcl-2 Bax, aumentando in questo modo la resistenza a stimoli apoptotici.

Figura 1.  Regolazione dell'apoptosi da parte di Bcl-xL Oltre a bloccare direttamente l'oligomerizzazione di Bax/Bak ed il rilascio di citocromo c dai mitocondri, Bcl-xL abbassa anche i livelli di acetil-CoA (possibilmente a causa di un effetto indiretto a monte dell'acetil-CoA), il chè risulta in una diminuzione della N-Alpha-acetilazione di mediatori apoptotici come caspasi-2, -3, -9 e Bax.  Nel caso della caspasi-2, l'N-Alpha-acetilazione è critica per la sua attivazione.

Figura 1. Regolazione dell’apoptosi da parte di Bcl-xL
Oltre a bloccare direttamente l’oligomerizzazione di Bax/Bak ed il rilascio di citocromo c dai mitocondri, Bcl-xL abbassa anche i livelli di acetil-CoA (possibilmente a causa di un effetto indiretto a monte dell’acetil-CoA), il chè risulta in una diminuzione della N-Alpha-acetilazione di mediatori apoptotici come caspasi-2, -3, -9 e Bax. Nel caso della caspasi-2, l’N-Alpha-acetilazione è critica per la sua attivazione.

                Enzimi distinti controllano l’acetilazione N-terminale delle proteine e l’acetilazione dei residui di lisina. L’acetilazione della lisina è apprezzata sempre di più come evento dinamico di segnale, mentre il ruolo della N-alpha acetilazione è più enigmatico.  L’N-alpha acetilazione è catalizzata dalla acetiltransferasi N-terminale (le NAT – che vanno dalla NatA alla NatF negli eucarioti) e si pensa che aiuti l’appropriata funzione, localizzazione, e stabilizzazione di certe proteine.  Tuttavia, la N-alpha acetilazione è considerata irreversibile, e studi precoci hanno dimostrato che molte proteine eucariotiche hanno questa modificazione, bollandola come modificazione globale necessaria per la funzione di molte proteine.  Le scoperte di Yi e coll suggeriscono che l’N-alpha acetilazione può avere più sfumature e varietà di ruoli biologici.

                Per monitorare l’N-alpha acetilazione delle proteine, gli autori usano una strategia inteliggente che coinvolge la biotinilazione mediata da subtiligasi e il legame dell’avidina solo delle proteine con un’estremità N-terminale libera.  Questi esperimenti rivelano che l’N-alpha acetilazione di regolatori dell’apoptosi è sensibile a cambiamenti acuti dei livelli di acetil-CoA, e ciò suggerisce che la soglia cellulare di morte è intimamente legata, attraverso questa modificazione, allo stato dei nutrienti.

                L’idea che una modificazione posttraslazionale come l’N-alpha acetilazione è regolata da livelli del substrato donatore, acetil-CoA, piuttosto che dagli enzimi che catalizzano la modificazione va contro il buon senso concernente altre modificazioni come fosforilazione, dove il donatore di fosfato ATP tipicamente non è limitante.  E’ interessante che una ancora piccola ma crescente letteratura suggerisca che l’acetilazione delle proteine è influenzata proprio dai livelli fluttuanti di acetil-CoA.  Per esempio, la stimolazione della produzione di acetil-CoA mediata dal glucosio attraverso la citrato liasi citrato/ATP determina un’aumentata acetilazione dell’istone e conseguente trascrizione di regolatori metabolici.  Queste osservazioni e quelle di Yi et al. implicano che i cambiamenti di un singolo metabolita, acetil-CoA, possano avere un grande effetto ondulatorio, alterando le vie di trascrizione, i circuiti metabolici, e la sensibilità apoptotica.

                La regolazione dell’acetilazione N-terminale probabilmente avviene anche a livello di acetiltransferasi.  Infatti, i complessi NAT mostrano preferenze diverse per sequenze di specifici amminoacidi N-terminali.  Inoltre, Yi et al. mostrano che l’ablazione mediata da RNAi di ARD1, un componente del complesso NatA, sensibilizza le cellule all’apoptosi e risulta nel fallimento dell’acetilazione N-terminale di una sottopopolazione di regolatori apoptotici.  Quindi, diverse NAT possono avere come bersaglio gruppi specifici di proteine.  Quindi, sfruttare l’approccio con la subtiligasi sviluppato da Yi e coll. per identificare i substrati di singole NAT dovrebbe essere illuminante.

                L’effetto antiapoptotico di Bcl-xL è generalmente attribuito alla soppressione del rilascio di citocromo c attraverso l’inibizione di Bax/Bak.  Tuttavia, più di una decade fa, il laboratorio di Harwick ha dimostrato che i mutanti di Bcl-xL incapaci di legare Bax/Bak mantengono ancora fino all’80% della loro attività antiapoptotica.  Yi et al mostrano che quegli stessi mutanti sopprimono i livelli di acetil-CoA, suggerendo che alterare l’acetilazione N-terminale della proteina attraverso la modulazione di questo metabolita possa contribuire significativamente all’attività anti-apoptotica di Bcl-xL.

                Ovviamente, questi dati fanno sorgere la domanda di come Bcl-xL influenza i livelli di acetil-CoA.  In condizioni di eccesso di glucosio, il citrato, un prodotto del ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA), esce dai mitocondri ed è convertito ad acetil-CoA dall’ATP citrato liasi.  E’ interessante che Yi e coll mostrino che la produzione stimolata di acetil-CoA, dovuta ad aggiunta di citrato al medium di coltura, sensibilizza le cellule alla morte indotta da doxorubicina, mentre l’ablazione da RNAi di ATP citrato liasi abroga questo effetto.  Per confermare ciò ulteriormente, Yi et al hanno scoperto che  i livelli di citrato sono ridotti in cellule che esprimono Bcl-xL.  Quindi, Bcl-xL forse svolge il proprio effetto sui livelli di acetil-CoA inibendo la produzione e/o l’esportazione di citrato.  Gli autori suggeriscono che Bcl-xL blocchi l’esportazione di citrato dal mitocondrio interagendo con il canale anionico dipendente dal voltaggio (VDAC), un componente del complesso dei pori mitocondriali che può regolare l’efflusso del metabolita.  L’espressione di Bcl-xL può inibire anche la proliferazione, che indirettamente potrebbe influenzare i livelli di acetil-CoA riducendo l’attività del ciclo TCA.  A questo proposito, è interessante notare che le attività che ritardano il ciclo cellulare e quelle antiapoptotiche di Bcl-xL co-segregano nei mutanti di Bcl-xL.  Inoltre, l’espressione di Bcl-xL altera le dinamiche della fusione/fissione mitocondriale che possono impattare nel metabolismo mitocondriale.

In una varietà di tipi tumorali, l’espressione di Bcl-xL è critica per la sopravvivenza cellulare e, quindi, è considerato un bersaglio terapeutico promettente.  Il lavoro di Yi et al. solleva argomenti importanti  a proposito del bersaglio di Bcl-xL e i suoi soci di segnale.  Per esempio, in cellule tumorali in cui, Bcl-xL è altamente espresso, come l’abbassamento dei livelli di acetil-CoA influenza le necessità biosintetiche della cellula, in particolare per la sintesi degli acidi grassi? Che effetto ha Bcl-xL sull’acetilazione della lisina, che ha anche bisogno di acetil-CoA e probabilmente avrebbe un impatto sulle vie metaboliche del cancro?  Nonostante queste ed altre domande rimangano, Yi et al forniscono delle forti evidenze di un meccanismo semplice ed elegante attraverso cui i livelli di un singolo metabolita, l’acetil-CoA, può regolare direttamente la sensibilità cellulare all’apoptosi.

(Tratto da Joshua L. Andersen e Sally Kornbluth, “Meeting the (N-terminal) End with acetylation”, Cell 146, August 19, 2011)

Mi scusi dottore

Posted in libri with tags , , , on March 10, 2014 by Domenico Delfino

Posso tirare bei soldoni

” La donna è stata tamponata da un auto mentre viaggiava col motorino ed il figliolo dodicenne sul portapacchi.

Il ragazzo ha riportato una ferita al ginocchio che ha richiesto dodici punti di sutura al pronto soccorso ed escoriazioni multiple.  Lei contusioni ed escoriazioni in varie parti del corpo.

Viene in ambulatorio allo scadere dei venti giorni di prognosi del figlio (per lei ne erano previsti dieci) e porta con sé i referti dell’ospedale.

“Dottore, sono stata dall’avvocato e mi ha detto che mi deve fare i certificati, tre mesi per lui e due per me”.

“Mi faccia vedere i referti, devo vedere la ferita, ci vorranno accertamenti.  La botta è stata grossa per entrambi, ma come si fa a stabilire in anticipo con esattezza quanti giorni ci vorranno? Daremo i giorni necessari.

“Senta dottore, l’avvocato ha detto così, ha detto anche che i certificati li può fare qualunque medico, perciò se non li fa lei mi rivolgo ad un altro”.

La donna che parlava sembrava un’altra, non era più la ragazza educata e rispettosa che da tanti anni veniva in ambulatorio per i suoi consulti.  Ora i suoi occhi avevano uno sguardo cattivo, la voce e i lineamenti mostravano una decisione inconsueta.

“Quella dell’avvocato è una questione assicurativa, la mia una questione medica.  I certificati devono seguire l’evoluzione delle ferite, vanno fatti sino alla guarigione, ma non le posso dire in anticipo quanti giorni ci vorranno.  Può darsi che siano necessari più di tre mesi, ma adesso è prematura ogni ipotesi”.

“Niente da fare.  L’avvocato ha detto che con un incidente del genere si possono tirare bei soldoni.  Ha parlato di milioni, senza tener conto dei postumi”.

“Mi pare che lei sia più preoccupata dei soldi che della salute di Simone (si chiamava così il figlio).  E poi attenzione a parlare di postumi, vogliono dire anche danni permanenti per il ragazzo.  Le piacerebbe che rimanesse zoppo per tutta la vita?”:

La signora non intende ragioni e taglia corto:

“Intanto mi faccia i certificati, poi si vedrà”.

Andò a finire che dopo i primi due certificati si rivolse ad un altro sanitario ed io la persi di vista.

Questa la mentalità nell’anno di grazia 1998.

Quando capita un incidente, prima di andare dal medico l’infortunato fa una capatina dall’avvocato per sapere quanto può ricavare o quanto può rimetterci.

Il legale è pagato per dare consigli:” Mi porti i certificati per novanta giorni e poi mi incaricherò io di farle avere i quattrini”.

Il medico si trova, così, stretto tra la coscienza professionale, l’interesse dell’assistito, e la possibilità di perdere il paziente: è un trilemma di non facile soluzione.”

(Tratto da Francesco Giuseppe Romeo “Mi scusi dottore – splendori e miserie di una nobile arte”, Mosby Italia, 1998)

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