In seguito a danno del DNA ed altri stressogeni, si attiva il soppressore tumorale p53, che porta all’espressione transitoria dell’inibitore chinasico ciclina-dipendente (CKI) p21. Questo può o innescare un momentaneo arresto della fase G1 del ciclo cellulare o portare ad uno stato di cronica senescenza o all’apoptosi, come forme di controllo del genoma. In clinica, la presenza di p21 è stato considerato un indicatore dell’attività di base di p53. Tuttavia, evidenze recenti suggeriscono che p21 agisce anche come fattore oncogenico in un ambiente deficiente di p53. Qui, discutiamo gli aspetti controversi del coinvolgimento a due facce di p21 nel cancro e speculiamo su come queste nuove informazioni possano aumentare la nostra comprensione del suo ruolo nella patogenesi del cancro. Le nozioni prevalenti indicano che p21 possa anche agire da agente anti-apoptotico, il chè può avere implicazioni rilevanti per future strategie terapeutiche.
Non è tutto su p53
Dall’esposizione a vari agenti intracellulari ed extracellulari, tessuti e cellule ricavano routinariamente dei danni alle loro biomolecole funzionali principali, incluso il DNA. In aggiunta ad errori del metabolismo, sorgenti di danno che agiscono sul DNA nucleare e mitocondriale includono, ma non sono limitati a, livelli eccessivi di specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto (ROS/RNS). Queste specie ossidative sono generate o intracellularmente come prodotti intermedi del metabolismo, o extracellularmente, dal rilascio associato ai macrofagi di radicali liberi correlati a risposte infiammatorie. Lesioni meno complesse, come rotture del DNA a doppia elica (DSB) che risultano da forchette di replicazione collassate, sono di solito riparate immediatamente dalla via di ricombinazione omologa (HR) finita senza alterare il vigore cellulare. Tuttavia, per forte contrasto, lesioni DSB del DNA più complesse e stress ossidativo indotto da oncogeni spingono verso una elevata proliferazione, stress replicativo e la risposta al danno del DNA (DDR). In aggiunta, in caso di danno persistente al DNA, evidenze recenti suggeriscono l’esistenza di un interscambio tra varie componenti del DDR, delle vie di riparazione del DNA (DDR/R) e della risposta immune (ImmR). E’ importante notare che scoperte come queste stiano gradualmente rivelando che, piuttosto che agire come processi lineari isolati, le vie di risposta biologica abbiano una sottostante natura comunicativa, con reciproche interazioni, soprattutto in condizioni di stress.
Una risposta cruciale a questi diversi tipi di stress cellulare è l’attivazione della proteina di soppressione tumorale p53, che trans-attiva geni bersagli a valle che determinano arresto del ciclo cellulare, senescenza, ed apoptosi, tutte azioni che prevengono la proliferazione e continuano l’esistenza delle cellule danneggiate. Un effettore importante di queste risposte p53 è p21 CKI (CDKN1A o WAF1/CIP1), una proteina che inibisce le chinasi cicline che sono necessarie per la progressione del ciclo cellulare. Tuttavia, si sono accumulate evidenze che puntano anche ad un nuovo, e potenzialmente dannoso, ruolo di p21 nel modulare il destino cellulare quando p53 è assente o malfunzionante, come nel caso di molti tumori. Qui, riassumiamo dati passati ed attuali che suggeriscono che c’è un ruolo divergente di p21, che scatena e da carburante ad una via sostenibile di carcinogenesi in presenza di p53 malfunzionante.
P21 come moderatore capo dell’attività del soppressore tumorale p53
Il gene umano CDKNIA che codifica per p21 è localizzato nel cromosoma 6 in posizione 6p21.2. In risposta a stress cellulari, p53 agisce su specifici geni a valle, come p21 e Mouse Double Minute 2 homolog (MDM2), in vie conservate tra specie di mammiferi. L’attivazione della proteina bersaglio di p53, p21, porta alla stabilizzazione del complesso DREAM (dimerization partner, RB-like, E2F and multi-vulval class B), che è centrale nella diminuita espressione di geni correlati al ciclo cellulare. Studi recenti basati sulla genome-wide bioinformatics ha identificato 210 geni con diminuita espressione attraverso la via p53-p21-DREAM-CDE/CHR, che sembra essere il meccanismo primario per l’arresto del ciclo cellulare in G2/M stimolato da p53.
P21 è attualmente accettato come un potente inibitore universale CDK (CKI). Interagisce fisicamente con, e inibisce, l’attività dei complessi ciclina-CDK2, -CDK1, e –CDK4/6, funzionando quindi come regolatore della progressione del ciclo cellulare durante le fasi G1 ed S (Figura 1A, figura chiave). In aggiunta all’arresto della crescita, p21 può mediare la senescenza cellulare attraverso vie dipendenti o indipendente da p53, come dimostrato in una varietà di cellule e tessuti di mammifero. Infatti, p21 è stato inizialmente identificato come un gene eccessivamente espresso in fibroblasti umani normali diploidi senescenti e, pochi anni dopo, abbiamo scoperto di poter indurre senescenza prematura in cellule H1299 di cancro umano di polmone senza p53. Scoperte datate hanno anche suggerito che p21 media la senescenza attraverso un meccanismo mediato da ROS che non richiede il legame con Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) o le funzioni di inibizione di CDK che condivide con p16. Questo studio ha mostrato che p21 aumenta i livelli di ROS sia in fibroblasti normali che in cellule tumorali negative per p53. L’uso di antioxidant N–acetyl-l-cysteine (NAC) determina il recupero dalla senescenza mediata da p21, e ciò sostiene la nozione che l’aumento dei ROS è essenziale per un fenotipo con arresto permanente della crescita. Mentre p21 serve come inibitore dell’attività di Cdk2, alcune evidenze da uno studio su fibroblasti primitivi embrionali umani mancanti dei geni che codificano sia p21 che p27 suggeriscono che p21 serva anche come fattore di assemblaggio per i complessi di Cdk4 e Cdk6. C’è anche un rapporto in vitro su fibroblasti diploidi umani che suggerisce che p21 è uno scarso inibitore di Cdk1.
Figura 1. L’induzione del danno da agenti ambientali (radiazioni o sostanze chimiche) o da tipi di stress endogeno (stress da replicazione) induce le vie di risposta e riparazione (DDR/R) al danno del DNA. In risposta a stress ed attivazione DDR/R in un ambiente con p53 funzionante, p53 è attivato e stabilizzato attraverso la propria fosforilazione da chinasi ATM/ATR. p53 quindi transattiva il suo bersaglio, l’inibitore chinasico dipendente dalle cicline p21, inducendo la sua espressione transitoria. (A) in un ambiente con p53 normale, p21 agisce da guardiano del genoma. L’attivazione della via p53/p21 può innescare un momentaneo arresto del ciclo cellulare in G1 o portare ad uno stato cronico di senescenza o apoptosi. Molte funzioni di p21 sono mediate dal suo legame con il proliferating cell nuclear antigen (PCNA), una proteina che funge da morsa di scivolamento del DNA coinvolta in funzioni essenziali del ciclo cellulare, come la replicazione e la riparazione del DNA. La regolazione generale della replicazione è ottenuta principalmente con la degradazione dei fattori licenzianti CDT1 e CDC6 e, quindi, adotta una natura da guardiano (la faccia sorridente). (B) in un ambiente deficiente di p53, si rivela la natura “oscura” (la faccia tragica) di p21. Nuove evidenze supportano la possibilità di un meccanismo patofisiologico in questo ambiente che coinvolge l’espressione protratta di p21 che porta alla disregolazione del macchinario di licenza proliferativa, stress replicativo, ed instabilità genomica. In maniera dipendente da CDT1/CDC6, lo stress replicativo potenzia l’emergenza di una sottopopolazione di cellule positive per p21 (“cellule in fuga”) con alta capacità proliferativa e aggressività aumentata. Queste cellule “in fuga” hanno superato la barriera della senescenza e sono caratterizzate da elevata instabilità genomica.
Appena dopo la sua scoperta, p21 è divenuta uno dei migliori esempi di proteina rilevante per molteplici discipline biologiche, incluse patologia (scoperte iniziali) e biologia delle cellule cancerose, ed è stata studiata utilizzando una varietà di mezzi molecolari e modelli di organismi. Gli effetti e le funzioni positive chiave di p21 erano correlati con la regolazione del ciclo cellulare, la riparazione del DNA, la modulazione dell’apoptosi, l’induzione della senescenza, e la regolazione indipendente da p53 della trascrizione del gene codificante CDKNIA (Box 1). Un esteso studio di microarray ha dimostrato che l’espressione di p21 correla positivamente sia con la soppressione dell’attività di geni direttamente coinvolti nella progressione del ciclo cellulare che con l’attivazione di geni associati alla senescenza. In questo studio, i ricercatori hanno sottoposto una linea cellulare di fibrosarcoma umano (HT1080) con espressione “spenta” di p21 ad analisi di cDNA array, esaminando gli effetti di p21 sulla espressione cellulare di geni. Gli autori hanno scoperto che alcuni di questi geni indotti da p21 codificavano proteine con effetti paracrini sulla crescita cellulare e apoptosi. Queste scoperte erano anche supportate da aumentate attività anti-apoptotiche e mitogeniche scoperte in cellule trattate con medium condizionato da colture indotte da p21. Quest’ultimo ruolo assomiglia strettamente alle attività paracrine di cellule senescenti e di funzioni che prumuovono il tumore in fibroblasti stromali in tessuti umani ed animali. La delezione omozigote del gene p21 in fibroblasti embrionali di topo aboliva completamente l’arresto in G1 indotto da danno al DNA dovuto a radiazioni ionizzanti. E’ stato anche visto che p21 è indotto da, e regola la risposta cellulare a, vari agenti genotossici ambientali, incluse sostanze chimiche (arsenico, metalli pesanti, mercurio, asbesto, inquinanti dell’aria, pesticidi, fitochimici, etc.) e tossine (batteriche, micotossine, animali, etc.), come descritto recentemente. Tuttavia, è stato anche visto che bassi livelli di p21 in cellule ciclanti sono importanti nella regolazione della replicazione del DNA e per preservare la stabilità genomica. Infatti, in cellule umane di osteosarcoma U2OS, la deplezione di p21 risulta in un rallentamento dell’allungamento del DNA nascente, nell’innesco di difetti permanenti di replicazione, e nel promuovere instabilità di regioni tendenti alla rottura che si replicano lentamente, come i common fragile sites (CFS).
Box 1. La natura a due facce di p21 potrebbe dipendere dalla sua localizzazione subcellulare
In cellule normali, p21 è strettamente controllato in risposta a stimoli genotossici. Partecipa all’arresto del ciclo cellulare in seguito alle risposte al danno del DNA che innescano arresto ed inibizione del ciclo cellulare. Insieme a molte cicline e CDK, p21 può risiedere sia nel nucleo che nel citoplasma. Generalmente si pensa che il ruolo principale di p21 nella crescita w sopravvivenza cellulare dipende dalla sua distribuzione subcellulare. La concentrazione citoplasmatica di p21 favorisce crescita e sopravvivenza cellulare, dove potrebbe agire come chaperone per la ciclina E, mentre la concentrazione nucleare di p21 potrebbe risultare nella sua consolidata funzione di arresto del ciclo cellulare ed inibizione della crescita in risposta ad un danno del DNA irrisolto.
Quando è nel nucleo, p21 potrebbe agire da soppressore tumorale: potrebbe inibire le CKI nell’arresto del ciclo cellulare in G1 o G2/M iniziato da p53; potrebbe ridurre l’espressione di molte, ma non tutte, le vie di riparazione del DNA; potrebbe limitare la proliferazione delle cellule staminali; e potrebbe anche indurre senescenza.
Quando p21 è concentrata nel citoplasma, le cellule con p53 assente o danneggiata potrebbero acquisire proprietà oncogeniche: ciò potrebbe inibire l’apoptosi, facilitare la migrazione, e promuovere la proliferazione.
P21 modula la riparazione del DNA: Una partecipazione generalmente negativa?
Studi sugli effetti di p21 nella riparazione del DNA riportano risultati contraddittori riguardo al suo ruolo sia come stimolante (positivo) che reprimente (negativo) di varie vie di riparazione del DNA. Facendo un bilancio, c’è consenso nel pensare che generalmente essa eserciti un effetto negativo. Ciò è consistente con la scoperta che p21 si lega a PCNA e può avere un effetto inibitorio tramite competizione e spiazzamento dei componenti della riparazione del DNA associati a PCNA. Ciò è simile anche all’effetto di p21 sulla sintesi del DNA, come è stato rivelato dall’analisi dell’interazione con i fattori Base Excision Repair (BER), e tramite la valutazione della risposta di fibroblasti umani p21-/- nel danno al DNA, indotto da agenti alchilanti. Studi iniziali con cellule di cancro del colon umano HCT116 p21+/+ o p21-/- esposte agli ultravioletti (UV) o al cis-platino hanno rivelato un effetto positivo di p21 nel rilevamento e riparazione delle lesioni del DNA gestite principalmente da Nucleotide Excision Repair (NER). Allo stesso modo, usando un sistema di espressione inducibile con tetracicline, un altro lavoro ha dimostrato che p21 può influenzare positivamente NER nella riparazione delle lesioni del DNA indotte da UV in assenza di p53 nativa in cellule DLD1 di carcinoma colorettale. Adesso è accettato che la capacità di p21 di inibire la funzione di PCNA nella replicazione del DNA, ma non nel NER (dipendente da PCNA), potrebbe aiutare a spiegare i dati in vivo che mostrano che il danno genetico può portare all’inattivazione della replicazione, mentre allo stesso tempo può permettere il DDR e la riparazione. Più specificamente, queste scoperte sostengono l’idea che p21 possa agire selettivamente, consentendo la riparazione del DNA mentre inibiscono la replicazione del DNA. Studi successivi hanno anche mostrato che la diminuita espressione o la delezione del gene CDKN1A bersaglio di p21 in fibroblasti embrionali di topo Ddb2-/- deficienti di NER restaura l’attività NER, suggerendo che p21 reprime l’attività NER. In aggiunta, diversi lavori suggeriscono un ruolo soppressivo di p21 nel mismatch repair, nella DNA TranLesion Synthesis (TLS), e nella Long-Patch Base Excision Repair (LP-BER). A riguardo della BER, il reclutamento di PCNA e PARP-1 nei siti del DNA danneggiato è più alto in fibroblasti umani p21-/-, ed è stato mostrato che p21 inibisce l’attività di ribosilazione dell’ADP di PARP-1, e la sua associazione con PCNA. Questi studi hanno suggerito che, in assenza di p21, PARP-1 rimane legato al DNA in una forma “auto-modificata”, dilazionando così la riparazione del DNA. Quindi, questi risultati suggeriscono che l’interazione spaziotemporale di p21 con PCNA è controbilanciata, da una parte, dalle interazioni di PCNA con vari fattori di riparazione e di trascrizione del DNA e, dall’altra parte, dalla ubiquitin-dependent pathway di p21 o dalla proteasomal degradation, in seguito ad esposizione agli UV. E’ stato riportato che questa degradazione di p21 iniziata dagli UV faciliti la replicazione del DNA danneggiato ed aiuta a preservare la stabilità genomica. In aggiunta, p21 può modulare TLS (un processo importante per superare le forchette di stallo della replicazione) inibendo la degradazione del PCNA attraverso la monoubiquitilazione. In totale, questi dati suggeriscono che gli agenti che danneggiano il DNA, come gli UV, promuovono la diminuita espressione di p21 attraverso un ruolo nella ubiquitilazione efficiente di PCNA in seguito ad irradiazione UV. Tuttavia, da un’altra angolazione, la degradazione di p21 in seguito ad irradiazione UV potrebbe anche promuovere la riparazione dipendente da PCNA.
Vari tipi di radiazioni ionizzanti (IR), come raggi-γ, -X, protoni, carbonio, e ioni pesanti, così come molti farmaci chemoterapeutici, tipo bleomicina, inducono tipologie altamente complesse di danno del DNA comprese DBS, single-strand breaks (SSB), siti abasici, e basi ossidate tutte raggruppate in pochi nanometri dell’elica del DNA. Queste lesioni complesse del DNA sono resistenti alla riparazione e possono stimolare risposte immuni. Ci si può aspettare che attivino tutte le principali vie di riparazione, incluse HR e NonHomologous End Joining (NHEJ). Se questa attivazione globale non riesce a riparare accuratamente il DNA, le cellule possono fermare la proliferazione a causa di apoptosi o senescenza, ma è importante notare che alcune possono anche continuare a sopravvivere con elevata instabilità genomica, che è una pietra miliare del cancro. Evidenze suggeriscono che p21 è coinvolta nella riparazione di danno al DNA complesso generato da un pesante bombardamento ionico. Specificamente, dopo bombardamento di fibroblasti umani con ioni accelerati di piombo o cromo, è stato visto che p21 colocalizza in foci con le proteine di riparazione DSB, Mre11 e Rad50, indipendentemente da complessi funzionali TP53 (p53 umano) o Mre11/Rad50/NBS1. Allo stesso modo quando è paragonato all’esposizione a raggi-X, il bombardamento di cellule di carcinoma polmonare A549 con ioni di carbonio ha indotto una più elevata espressione di p21 accoppiata con un maggiore quantità di senescenza, specialmente in presenza dell’inibitore NU7441 della DNA-dependent Protein Kinase catalytic subunit (DNA-PKcs). In un altro studio con radiazioni laser per indurre danno al DNA localizzato complesso, è stato visto che EGFP-p21 si accumula rapidamente nei siti irradiati, e colocalizza con γ-H2AX e con la proteina Ku80, sensore di DSB. Questo accumulo avviene indipendentemente da p53 e dalla proteina core chiave NHEJ, come la DNA-PKcs, ma era dipendente da PCNA. Al contrario, in seguito ad esposizione a raggi-X (meno dannosi delle radiazioni atomiche o del danno da laser), p21 non colocalizza nei foci con γ-H2AX o 53BP1 (marcatori DSB). Per spiegare queste scoperte, gli autori suggeriscono che p21 non sia coinvolto nella riparazione DSB per se ma piuttosto, possa avere un ruolo da orchestratore nel regolare le interazioni di PCNA con varie proteine richieste per una fedele ed efficiente LP-BER. Tuttavia, un ruolo da orchestratore di p21 sembra strano se si pensa al ruolo inibitorio suggerito da molti studi discussi prima.
Non ultimo, è stato riportato un ruolo critico per p21 nella riparazione del DNA DSB accoppiata alla replicazione. Specificamente, questo studio ha mostrato che le cellule HCT116 p21-/- (carcinoma del colon umano) esibivano un livello aumentato di fosforilazione di DNA-PKCS S2056 indotta dal danno al DNA, suggestivo di un aumento di NHEJ e di una concomitante deficienza in HR accoppiata alla replicazione. In questo caso, l’assenza di p21 è stata proposta per mandare in stallo le forchette di replicazione del DNA prone ad un attacco nucleolitico non corretto mediato da MRE11 e a vie di riparazione prone all’errore (come NHEJ), che eventualmente potrebbero portare ad aumentata instabilità genomica.
Attualmente, gli studi appena discussi indicano che il coinvolgimento di p21 nella riparazione del DNA potrebbe differire a seconda dello scenario sperimentale, incluso, ma non limitato a, il modello biologico ed il tipo di danno indotto del DNA. Sembra che p21 abbia un ruolo regolatorio centrale, spesso come attivatore, con aumento dei livelli e/o della fedeltà delle vie di riparazione del DNA, come la riparazione BER o DSB. Questa azione è indipendente da p53 ed avviene attraverso la sua interazione con PCNA. Tuttavia, sembra anche che p21 abbia un ruolo soppressivo nella riparazione NER e indotta da UV.
Le due facce di p21 nell’ambiente cellulare
Fin dalla sua scoperta, vari studi hanno esplorato ruoli, meccanismi, e associazioni totali di p21 con la terapia del cancro e la sopravvivenza cellulare. Studi in vitro e chemoterapeutici iniziali hanno portato a risultati contraddittori per p21, riportando in alcuni casi chemosensibilizzazione, ed in altri chemoresistenza. Per esempio, usando cellule HCT-116 di cancro del colon umano e fibroblasti embrionali murini (MEF) con gene di p21 intatto o ablato, gli esperimenti hanno mostrato che cellule senza p21 possedevano una sensibilità preferenziale al cisplatino e alle mostarde azotate, farmaci che agiscono tramite un meccanismo d’azione che implica NER. Al contrario, è stato suggerito che la perdita funzionale o la diminuzione dell’espressione di p21 medii un fenotipo farmaco-resistente in seguito a terapia del cancro. Uno studio recente ha riportato che, in seguito a danno del DNA, è stato trovato che il miRNA miR-33b-3p promuove la sopravvivenza di cellule A549 di cancro del polmone umano e resistenza al cisplatino agendo su p21. Inoltre, silenziando l’espressione di miR-33b-3p in una linea cellulare A549 resistente al cisplatino si ri-sensibilizzavano le cellule al cisplatino. Studi paralleli hanno indicato che miR-520g mediava la resistenza delle cellule di cancro colorettale all’apoptosi indotta da 5-fluorouracile (5-FU) o oxaliplatino attraverso la diminuita espressione di p21. Al contrario, molti studi supportano la nozione che la presenza di p21 possa agire da protezione dall’apoptosi delle cellule cancerose in seguito a trattamento anti-cancro, il chè implica che abbassare l’espressione di p21 dovrebbe in conseguenza sensibilizzare le cellule tumorali ai IR o agli agenti chemoterapeutici. Per esempio, è stato trovato che p21 inibisce il clivaggio della caspasi apoptotica iniziatrice da parte di Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (DR4/TRAIL) receptor, sopprimendo quindi l’apoptosi e offrendo un vantaggio di sopravvivenza a cellule di tumore della mammella e del cancro del colon umane. Inoltre, è stato suggerito un ruolo protettivo di p21 contro l’apoptosi mediata da prostaglandina A2 in cellule di carcinoma colorettale umano attraverso induzione dell’arresto della crescita cellulare.
Studi clinici sulla presenza o assenza di p21 nei tumori hanno di nuovo raccolto scoperte divergenti a proposito del suo ruolo nel cancro. In clinica, livelli elevati di p21 sono stati rilevati in molti tumori umani associati con scarsa sopravvivenza (gliomi, prostata, cervice uterina, ovaie, ed esofago) mentre in altri tumori (mammella, stomaco, e ovaie) la perdita dell’espressione di p21, insieme ad un aumento della rilevazione di p53, è stato correlato con una prognosi povera e diminuita sopravvivenza totale. In base alle evidenze iniziali, è probabile che molte funzioni di p21 promuovano la carcinogenesi e la progressione tumorale; queste funzioni includono, ma non sono limitate a, endoreduplicazione e mitosi anormale che compare nelle cellule tumorali dopo “l’evasione” dall’arresto di crescita indotto da p21, l’inibizione dell’apoptosi attraverso molti meccanismi diversi, e la stimolazione della trascrizione di fattori secreti con attività mitogeniche ed apoptotiche. In totale, si sta costruendo uno scenario alternativo su una p21 a due facce che può promuovere la proliferazione cellulare e l’oncogenesi insieme con il suo ruolo variabile in chemioresistenza e sopravvivenza, come abbiamo prima discusso. Alcuni studi hanno documentato che p53 può proteggere l’organismo tramite apoptosi di cellule che stanno andando incontro ad una re-replicazione. Specificamente, in seguito ad induzione di p21 in linee cellulari epiteliali umane, è stato mostrato che cellule con p53 nativo esibiscono una apoptosi massiva, insieme ad una drammatica diminuzione della espressione di proteine dei fattori di licenza replicativa CDT1 e CDC6. Al contrario, è stato mostrato che il silenziamento di p53 porta a soppressione dell’apoptosi, e ciò consente l’aumentata espressione di CDT1 e CDC6.
Molti altri rapporti hanno anche analizzato la capacità di p21 di abrogare o diminuire l’espressione delle risposte apoptotiche. Sono stati identificati nuovi bersagli per p21, distinti dalle chinasi ciclina-dipendenti. Per esempio, uno studio indica che cellule HepG2 di epatoma umano caricato con proteina p21 potevano resistere all’apoptosi mediata da Fas, anche in presenza del farmaco actinomicina D. In aggiunta, è stato visto che p21 citoplasmatica è espressa in eccesso in una varietà di tumori umani, inclusi il mammario, cervicale, prostatico, renale, testicolare, ed altri. L’aumentata espressione di p21 è correlata positivamente con il grado, l’aggressività, l’invasività, e la resistenza ai farmaci del tumore, ed è considerato un indice di prognosi povera. Si pensa che le basi di questa eccessiva espressione, anche se non completamente compresi, siano in relazione a dati che indicano che p21 citoplasmatica possa esibire funzioni antiapoptotiche in molte cellule tumorali, fornendo i mezzi per la resistenza chemioterapica.
Quindi, un’altra dimensione della natura a due facce di p21 è la correlazione con la sua presenza nel citoplasma o nel nucleo. La localizzazione nucleare di p21 sembra favorire i suoi effetti soppressivi tumorali, mentre la sua localizzazione ed aumentata espressione nel citoplasma sposta l’equilibrio verso le sue proprietà oncogeniche (Box 1). Evidenze a supporto di questa nozione vengono da molti studi di immunoistochimica (IHC) con cellule o tessuti di tumori umani. Questi studi suggeriscono che la localizzazione subcellulare di p21 può influenzare la sua funzionalità finale. La localizzazione citoplasmatica è legata alle azioni antiapoptotiche che aumentano la crescita e la sopravvivenza cellulare, probabilmente perché p21 agisce da chaperone della ciclina E; al contrario, la localizzazione nucleare potrebbe indirizzare la funzione di p21 verso l’inibizione della divisione e crescita cellulare. A supporto della teoria della funzione oncogenica di p21 correlata al citoplasma, gli studi suggeriscono che, al contrario delle cellule normali, fibroblasti umani trasformati e cellule tumorali, che sono indipendenti dall’ancoraggio, ospitano più del 50% del loro contenuto in ciclina E, Cdk2, p21 e p27 dentro la frazione citoplasmatica, sia in colture aderenti che in sospensione.
Una recente scoperta ha rivelato che l’eccessiva espressione cronica di p21 (> 10 giorni) in un ambiente senza p53 agiva come un potente filtro di selezione, promuovendo la fuga di una sottopopolazione di cellule da uno stato simile alla senescenza e promuovendo lo stress da replicazione dovuto alla continua replicazione (figure 1B). Gli autori hanno utilizzato due sistemi cellulari umani inducibili con doxiciclina (Tet-ON) che esprimevano p21: uno ricapitolava la fase cancerosa, usando cellule Saos2 (una linea cellulare di osteosarcoma senza p53) e l’altro simulava la fase precancerosa esprimendo il modulo inducibile in fibroblasti derivati da pazienti Li-Fraumeni (MDAH041-Li-Fraumeni p21 Tet-ON). Questa sottopopolazione di cellule “in fuga” con espressione protratta di p21 esibiva una aumentata instabilità genomica, aggressività, e chemioresistenza alla doxorubicina in vitro in risposta ad una licenza di replicazione disregolata. Meccanicisticamente, una espressione costantemente elevata di p21 in questo ambiente deficiente di p53 abrogava la capacità di PCNA di regolare correttamente il ciclo degradativo dei fattori di licenza replicativa CDT1 e CDC6, innescando lo stress da replicazione. In questo caso, l’instabilità genomica ha avuto come carburante uno slittamento nella riparazione DSB del DNA dalla più accurata HR alle vie di riparazione tendenti all’errore mediate da microomologia marcate da alta espressione di Rad52 ed una concomitante riduzione dei livelli di Rad51. E’ accettato che il declino di Rad51 determini uno slittamento dalla HR ad alta fedeltà ad un processo di riparazione a fedeltà inferiore mediato da Rad52 e che necessita una omologia molto minore (microomologia). Infatti, le perturbazioni del ciclo cellulare riflettono comunemente la disregolazione di vie molecolari specifiche. Uno può congetturare che, da un punto di vista meccanicistico, il caso dell’induzione cronica di p21 in uno scenario deficiente di p53 denoti un caso emblematico di inibizione enzimatica competitiva, dove il substrato con la costante di dissociazione (Kd) più alta previene il legame di altri substrati all’enzima. Tra tutti i soci di legame a PCNA esaminati, il peptide p21 ha l’affinità di legame più elevata (kd di circa 35-38 nM). Quindi, in condizioni di espressione cronica, p21 può competere con tutti gli altri cofattori di PCNA, cambiando le principali funzioni dipendenti da PCNA. Sotto la base concettuale di questa ipotesi, la prolungata espressione di p21 può abolire il controllo di PCNA al di là del ricambio dei fattori di licenza replicativa CDT1 e CDC6, determinando una ri-replicazione. In linee cellulari murine ed umane, è stato riportato che CDC6 possiede la capacità di sopprimere il locus INK4A/ARF, deprivando le cellule di una importante barriera antitumorale. Inoltre, in linee cellulari umane ed in campioni neoplastici, la chinasi ATM può anche sopprimere ARF a livello proteico attraverso l’attivazione della via DDR. Ciò potrebbe fornire un doppio meccanismo di soppressione contro INK/ARF. Dato che il potenziale oncogenico di p21 è scatenato solo in condizioni di deficienza di p53, questi eventi cumulativi potrebbero lasciare le cellule non protette contro la progressione cancerosa, così delineando ulteriormente il potenziale oncogenico di p21. Di conseguenza, in un ambiente deficiente di p53, una importante barriera antitumorale potrebbe essere obliterata, aprendo la via alla instabilità genomica guidata dalla ri-replicazione.
Considerazioni conclusive
Qui, abbiamo descritto il carattere a due facce di p21 nella sopravvivenza cellulare e in carcinogenesi: in alcuni casi, può agire da guardiano del genoma e, in altri casi, da mediatore di instabilità genomica e probabilmente da carcinogenetico. La caratteristica distintiva di p21 che la discrimina da altre CKI è la sua capacità di associarsi a PCNA, una funzione essenziale per assicurare sia la replicazione del DNA e diverse risposte di riparazione del DNA in cellule sotto stress. In un contesto con p53 normale, p21 e p53 agiscono insieme come soci di salvezza dal danno al DNA e preservano la stabilità genomica, agendo così come guardiani del genoma. Tuttavia, quando il socio p53 è mutato o deficiente, p21 può adottare una diversa funzione “oscura”, promuovendo la fuga dalla senescenza e creando cellule di estrema instabilità genomica, che potrebbero agire come precursori del cancro nei tessuti del corpo umano. Le linee cellulari cancerose umane che esprimono p21 tramite induzione con doxiciclina (Tet-ON) recentemente derivate rappresentano strumenti unici in quanto consentono lo studio di vie coinvolte nel superamento della senescenza e nella riparazione del genoma. Dato che mutazioni di p21 sono eventi rari nel cancro, è possibile che, durante l’evoluzione di un tumore maligno umano in un contesto di p53 mutata, le cellule cancerose potrebbero essere a rischio di acquisire altri cambiamenti genomici dannosi a causa di una prolungata attività di p21 (Figura 1, Box 2). Questo fenomeno potrebbe aumentare l’instabilità delle cellule e promuovere l’eterogeneità tumorale, che porta a nuovi cloni di cellule cancerose che hanno oltrepassato la barriera della senescenza, usano riparazione con tendenza agli errori (non-HR), producono un fenotipo resistente ai farmaci. Queste nuove acquisizioni nella comprensione delle diverse funzioni di p21 potrebbero offrire delle armi uniche contro il cancro e fornire mezzi validi nella ottimizzazione dei trattamenti dei tumori deficienti di p53. Esplorare questi problemi potrebbe fornire una nuova strategia per lo sviluppo di farmaci che agiscono su vie correlate a p21 in queste alterazioni funzionali specifiche.
Box 2. L’angolo del clinico
La valutazione immunoistologica (IHC) di proteine soppressori tumorali chiave, come p53, è attualmente considerata di elevato valore nella pratica clinica, specialmente per diagnosi e prognosi. Tuttavia, valori IHC di p53 per la patologia tumorale devono essere esaminati attentamente, non solo per la sua espressione, ma anche a riguardo del suo status: che sia normale o mutato (p53-/+ o p53-/--null). Per esempio, l’eccessiva espressione di p53 è comune in alcuni tipi di cancro, come il cancro della mammella umano.
Per più di 20 anni, l’espressione proteica è stata considerata come indicatore solido di attività normale di p53 e, quindi, come potenziale marcatore di buona prognosi per il paziente. Tuttavia, ci sono anche evidenze di una possibile deviazione da questo concetto, in cui una elevata espressione di p21 si correla a invasione profonda e metastasi linfonodali nel tumore umano della mammella, il chè risulta in una prognosi generale povera. Allo stesso modo, è stato visto che topi doppio knock-out (Trp53-/-;Cdkn1a-/-) mostrano una ridotta incidenza di linfomi spontanei o indotti da radiazioni ionizzanti, al contrario di ciò che ci si sarebbe aspettato dalla perdita di p53 e p21.
E’ importante notare che, in base a queste scoperte recenti, i patologi dovrebbero stimare cautamente l’immunopositività di p21 nei tumori nella loro pratica quotidiana, quando valutano anche lo stato di p53. In attesa dell’esame dello stato di p53, la rilevazione di p21 basata sull’IHC è importante per determinare se l’eccessiva espressione di p21 è neutra e/o vantaggiosa per il paziente (con p53 normale) o se potrebbe nascondere caratteristiche deleterie (deficiente in p53). Quest’ultimo scenario potrebbe portare a eterogeneità tumorale, così come a potenziale recidiva tumorale ed aggressività.
Lo sviluppo di mezzi che possano rilevare accuratamente cellule senescenti nei tumori umani sarebbe un passo verso l’utilizzazione di ampi depositi di materiale d’archivio disponibile nelle cliniche e nei laboratori. Per esempio, il Sudan Black B è uno specifico colorante istochimico per la lipofuscina, che può essere usata come marcatore di senescenza cellulare. Lo sfruttamento di questo ed altri mezzi nel rilevare la senescenza nei tumori umani con vari profili molecolari di p53/p21 potrebbe risultare in futuri benefici.
Tendenze
In cellule normali, p21 mantiene la propria genuina funzione caratteristica come inibitore del ciclo cellulare ed effettore antiproliferativo. P21 può mediare la senescenza cellulare attraverso vie dipendenti o indipendenti da p53.
Mentre p21 media la senescenza cellulare, sembra che eserciti effetti opposti, principalmente inibitori, ma qualche volta stimolatori, su varie vie di riparazione del DNA come le riparazioni base excision (BER) e nucleotide excision (NER).
In cellule con un danno al DNA complesso compresi i double-strand breaks (DBS) e le basi danneggiate in stretta vicinanza le une alle altre, le evidenze indicano che p21 è reclutato nei siti danneggiati, specificamente nei DBS, e colocalizza con proteine di riparazione DSB per facilitare la loro riparazione.
P21 è un regolatore a due facce a seconda del tipo cellulare, della localizzazione cellulare, dello stato di p53, e del tipo e livello di stress genotossico. Può acquisire o proprietà oncosoppressive o oncogeniche in dipendenza dell’ambiente, rispettivamente, p53-proficiente o p53-deficiente.
In uno stato di deficienza di p53 combinata all’espressione costitutiva di p21, una sottopopolazione di cellule può evadere dalla senescenza ed acquisire un fenotipo cancerogeno aggressivo e resistente alla chemioterapia con elevata instabilità genomica (cellule “in fuga”).
Glossario
Via base excision repair (BER): Nei casi di danno al singolo filamento (single-strand) di DNA, BER media il lavoro sulle lesioni della base e/o abasici. E’ iniziata da una delle molte DNA glicosidasi specializzate, che riconosce e catalizza la rimozione delle basi danneggiate. Ber agisce attraverso due vie principali: la short-patch BER (SP-BER) agisce su un singolo nucleotide, mentre la long-patch BER (LP-BER) agisce su più di due nucleotidi.
Bleomicina: un farmaco citotossico antitumorale usato nel trattamento dei linfomi Hodgkin e non-Hodgkin, melanomi, cancro a cellule squamose, ed altri. La bleomicina è considerata “radiomimetica” a causa della sua capacità di indurre danni complessi al DNA, come il DNA double-strand breaks (DSB) che deriva dalla formazione di due rotture vicine del doppio filamento di DNA e da lesioni delle basi.
Senescenza cellulare: fenomeno attraverso cui le cellule smettono di dividersi. Non si replicano più ma rimangono metabolicamente attive. La senescenza potrebbe avere una origine replicativa a causa dell’accorciamento dei telomeri o come risultato di un danno eccessivo del DNA. E’ generalmente accettato che la senescenza indotta da oncogeni dovuta ad danno ossidativo del DNA e ad errori di replicazione fa parte della barriera tumorigenica rafforzata dai checkpoint di danno del DNA.
Cis-platinum (cisplatino): un farmaco chemioterapico usato per il trattamento di molti tumori (mammella, vescica, cervice uterina, testa e collo, ovaio, testicoli, etc.). Il cisplatino interferisce con la replicazione del DNA agendo sulle cellule che si stanno proliferando rapidamente (spesso cellule tumorali). Lega ed incrocia il DNA e gli addotti cisplatino-DNA sono principalmente bersaglio del nucleotide excision repair (NER). La resistenza al cisplatino è spesso associata a mutazioni NER.
Common fragile sites (CFS): regioni cromosomiche specifiche ereditabili tendenti a formare buchi o rotture su cromosomi metafasici in cellule sotto stress replicativo. L’induttore più tipico di CFS è l’antibiotico aphidicolin, un inibitore della DNA polimerasi. I CFS sono considerati una parte normale del genoma umano e sono relativamente stabili quando non sono sotto stress replicativo.
Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI; anche noti come CDI o CDKI): protein che inibiscono le chinasi dipendenti da cicline e sopprimono la progressione del ciclo cellulare. In generale, possiedono ruoli chiave nel coordinare proliferazione e sviluppo cellulare, e di solito funzionano da geni soppressori tumorali. P21 è considerato un CKI tradizionale; altri esempi includono p15, p16, p18, p19, p27, e p57.
Dimerization partner, RB-like, E2F e multi-vulval class B (DREAM): complesso proteico coinvolto nella regolazione dell’espressione genica dipendente dal ciclo cellulare: E’ evolutivamente conservato, anche se la sua sintesi varia da specie a specie. DREAM facilita la repressione genica durante la fase di quiescenza G0 e coordina la periodica espressione genica che raggiunge un picco durante le fasi G1/S e G2/M. E’ stato proposto che i componenti chiave includono le proteine RBL1 (p107) ed RBL2 (p130), entrambe omologhe di RB (p105), di solito legando i fattori di trascrizione E2F.
DNA damage response (DDR): una rete di risposta a multicomponenti attivata quando il livello del danno al DNA e/o gli impedimenti alla replicazione superano una certa soglia. Le due protein chinasi, ataxia-telangectasia mutated (ATM) e ataxia telangectasia and RAD3 related (ATR), agiscono da componenti di segnalazione, attivando le protein chinasi CHK1 e CHK2, tra altri bersagli. Insieme ad ATM e ad ATR, CHK1 e CHK2 diminuiscono l’attività della cyclin-dependent kinase (CDK), spesso mediata dall’attivazione del fattore di trascrizione p53. Il risultato della combinazione della risposta al danno del DNA e alla via di riparazione (DDR/R) è l’arresto coordinato della progressione del ciclo cellulare e l’inizio di varie vie di riparazione del DNA.
DNA double-strand breaks (DBS): rotture vicine in entrami i filamenti dell’elica del DNA. La riparazione avviene attraverso due vie principali: la via fedele di ricombinazione omologa (HR) e la via maggiormente tendente all’errore della nonhomologous end-joining (NHEJ). In aggiunta, ATM ed ATR fosforilano rapidamente molte molecole di istone H”AX adiacentiai siti DSB (γ-H2AX), che insieme, agiscono come centro per il reclutamento di miriadi di fattori di riparazione del DNA e dei cromosomi, aumentando l’efficienza della riparazione DSB.
DNA translesion synthesis (TLS): quando le lesioni del DNA non sono riparate e la cellula va in replicazione, la via TLS si attiva come via di tolleranza al danno del DNA ma con risposta tendente all’errore. Per superare le lesioni del DNA che bloccano la replicazione del DNA, TLS DNA polimerasi specializzate sono reclutate nel sito (per es., la famiglia Y di polimerasi). TLS o le polimerasi di superamento sono capaci di sintesi del DNA oltre il DNA danneggiato; DNA polimerasi replicative convenzionali riprendono quindi la normale sintesi del DNA.
Arresto G2/M del ciclo cellulare: dopo la fase S, le cellule entrano in fase G2, dove potrebbe avvenire la riparazione delle lesioni del DNA, insieme alla preparazione per la mitosi in fase M. il punto di controllo G2-M del danno al DNA negli organismi eucariotici è importante nell’assicurare che le cellule non entrino in mitosi (arresto del ciclo cellulare) prima che il danno al DNA sia riparato dopo la replicazione. Le cellule con un punto di controllo G2-M difettoso entreranno in mitosi senza completare la riparazione, e ciò di solito porta a morte cellulare in seguito a divisione cellulare, o ad aumentata instabilità cromosomica. P53 può fermare il ciclo cellulare: questo punto di controllo-G2 coinvolge l’inibizione di Cdc2, una CDK necessaria per l’entrata in mitosi.
Analisi bioinformatica genome-wide: la tecnologia che utilizza i dati ottenuti nell’attuale tratto più ampio di genoma (per es., analizzando la sequenza dell’intero genoma o di un diffuso trascrittoma o di dati metabolici).
Casapasi apoptotiche iniziatrici: una famiglia di enzimi proteasici con ruoli centrali nella morte cellulare programmata (apoptosi). Le caspasi iniziatrici (caspasi 2, caspasi 8, e caspasi 9) sono le caspasi apicali nelle cascate di segnale apoptotico. Le caspasi iniziatrici, come la caspasi 8, sono tagliate autopreoteoliticamente, ed iniziano l’apoptosi.
Sindrome Li-Fraumeni: un raro disordine ereditario, autosomico dominante, dove i portatori, soprattutto bambini e giovani adulti, hanno una predisposizione allo sviluppo di vari tipi di cancro.
Fattori di licenza CDT2 e CDC6: anche noti come Cdc10-dependent transcription factor 1 (CDT1) e cell division cycle 6 (CDC6): consentono solo un turno di replicazione per ciclo cellulare. Fanno parte del complesso pre-replicazione (pre-RC) e consentono una origine della replicazione (ORC) tale che la replicazione del DNA può iniziare in quel sito.
Via Mismatch repair (MMR): corregge i difetti di appaiamento delle paia di basi del DNA durante la sua replicazione, evitando che le mutazioni divengano stabili nelle cellule in divisione. Dal momento che MMR riduce il numero di errori associati alla replicazione, difetti della MMR aumentano il tasso di mutazioni spontanee.
N-acetil-l-cisteina (NAC): precursore dell’antiossidante naturale glutatione (GSH). Il gruppo tiolico (sulfidrile) è capace di eliminare una varietà di radicali liberi, conferendo così proprietà antiossidanti. Quando viene preso internamente, rifornisce i livelli intracellulari di GSH. E’ spesso usata come trattamento contro la tossicità da paracetamolo e l’insufficienza epatica acuta, o anche come agente antiinfiammatorio.
Via nucleotide excision repair (NER): Gestisce le lesioni di distorsione dell’elica (dimensioni), come quelle indotte da ultravioletti (UV) o gli addotti cisplatino-DNA; esistono molte sotto-vie.
Stress ossidativo indotto da oncogeni: la produzione di ROS indotta da oncogeni nelle cellule è considerato un aspetto essenziale dell’espressione di oncogeni e un passo vitale nella trasformazione cellulare. I ROS potrebbero agire sulle molecole dei segnali mitogenici che stimolano l’iperproliferazione cellulare o possono essere genotossici, attivando la DDR per fermare la proliferazione ed indurre senescenza.
Oxaliplatino: un farmaco chemioterapico basato sul platino, attualmente usato per trattare il cancro colorettale, esofageo, e dello stomaco; è stato saggiato in studi di ricerca per molti altri tumori.
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): una proteina di forma toroidale che include il DNA e scivola bidirezionalmente lungo l’elica (scivolando nell’aggregato con il DNA). Ha diversi ruoli cellulari, agendo come fattore di elaborazione per la DNA polimerasi δ nelle cellule eucariotiche ed anche come mediatrice del reclutamento di proteine. E’ implicata nel metabolismo degli acidi nucleici ed è considerata un componente decisivo del macchinario di replicazione e riparazione del DNA.
Fibroblasti stromali: queste cellule sintetizzano i componenti della matrice extracellulare ed il collagene, formando le basi strutturali per tutti i tessuti animali, il cosiddetto “stroma”. Nel caso dei tumori alla mammella, alla prostata ed al pancreas, questi fibroblasti sostengono la crescita e l’invasione dei tumori epiteliali, e sono spesso chiamati “stroma tumorale”.
Recettore del tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (DR4/TRAIL): TRAIL induce la morte cellular in cellule tumorali legandosi ai suoi recettori specifici, che sono DR4 o recettore 1 di TRAIL.
Vie dipendenti dall’ubiquitina: E’ il meccanismo principale per il catabolismo proteico nel citoplasma e nel nucleo di cellule di mammifero. Queste vie sono essenziali nella regolazione di molti processi cellulari, inclusi, ma non limitati a, apoptosi, ciclo cellulare e divisione cellulare, trascrizione e riparazione del DNA, risposta allo stress cellulare, e così via. L’aggiunta di una catena di copie multiple di ubiquitina etichetta una proteina per essere distrutta da una proteasi intracellulare, conosciuta come proteasoma 26S (degradazione proteasomica).
Domande eccellenti
Quando le cellule tumorali che mostrano una eccessiva espressione cronica di p21 in un ambiente deficiente di p53 fuggono dalla senescenza (“cellule in fuga”), quale via di riparazione utilizzano per riparare il danno al DNA indotto da radiazioni ionizzanti (per es., radioterapia)?
In che misura le “cellule in fuga” contribuiscono alla eterogeneità tumorale e ad un fenotipo resistente al trattamento?
Nella progressione continua di queste “cellule in fuga” verso stati di maggiore malignità, quale effetto di p21 si potrebbe perdere nel continuare tale progressione?
Come possiamo usare queste nuove acquisizioni per agire più efficacemente sulle “cellule in fuga” con terapie ottimizzate e nuovi bersagli farmacologici per p21?
(Tratto da Alexandros G. Georgakilas, Olga A. Martin, e William M. Bonner. P21: a two-faced genome guardian. Trends Mol Med, 2017;23:310-319, CellPress)
Domenico Delfino's Blog 
